Makanan apa yang mengandung peroksidase? Ensiklopedia besar minyak dan gas. Metode untuk memperoleh enzim peroksidase dari akar lobak

Metode ini melibatkan penghancuran dan homogenisasi akar lobak yang bertunas, mengekstraksi akar lobak yang telah dihomogenisasi dengan larutan natrium klorida 0,15±0,01 M. Protein pemberat dipisahkan dan peroksidase diendapkan dengan garam amonium sulfat masing-masing dengan saturasi 45-48% dan saturasi 85-90%. Filtrasi gel larutan peroksidase dilakukan pada Sephadex G-100 dengan elusi dengan larutan natrium klorida 0,15-0,2 M. Pemurnian kromatografi dilakukan pada karboksimetilselulosa. Peroksidase target dikeringkan dengan cara dibekukan. Dialisis dilakukan terhadap buffer natrium asetat dengan pH 4,4-5,0 dan dialisis terhadap buffer kalium fosfat dengan pH 8,0±0,1. Pemekatan dilakukan dengan pemurnian tambahan pada DEAE-selulosa dengan elusi dengan buffer yang sama, dilanjutkan dengan dialisis terhadap air deionisasi. Metode ini memungkinkan diperolehnya peroksidase dengan aktivitas spesifik tinggi dan hasil tinggi. Hasil peroksidase 2,52-3,50 g/kg akar lobak, aktivitas spesifik 640-700 EA/mg protein. 5 gaji f-ly, 2 sakit., 1 meja.

Gambar untuk paten RF 2353652

Invensi ini berkaitan dengan bidang bioteknologi yaitu produksi enzim dari bahan tumbuhan, dan dapat digunakan untuk keperluan laboratorium dan produksi industri enzim peroksidase dari akar lobak untuk imunologi dan imunokimia sebagai komponen utama konjugat untuk enzim immunoassay.

Berbagai metode diketahui untuk memperoleh peroksidase dari akar lobak.

Ada metode yang diketahui untuk memproduksi peroksidase dari akar lobak, termasuk homogenisasi akar lobak, ekstraksi enzim larutan garam, pengendapan enzim dengan garam amonium sulfat, filtrasi gel, pengendapan alkohol, elektroforesis, pengendapan ulang dengan amonium klorida, filtrasi melalui Sephadex G-50 dan DEAE-selulosa dan dialisis.

Kerugian utama metode ini adalah rendahnya aktivitas dan kemurnian produk yang dihasilkan, serta rumitnya penyiapan dan sejumlah besar tahapan proses teknologi.

Ada juga metode yang dikenal untuk memproduksi peroksidase dari akar lobak, dimana akar lobak dihomogenisasi, kemudian enzim diekstraksi dengan air dan peroksidase diendapkan dengan garam amonium sulfat, diikuti dengan filtrasi gel [Pat. Hongaria 172872, C07G 7/022].

Kerugian dari metode ini adalah rendemen yang rendah dan kemurnian enzim yang rendah.

Ada metode yang diketahui [A.S. Bulgaria 46675, C12N 9/08, 15/02/90], dimana akar lobak dikecambahkan selama 2-3 hari, kemudian dihomogenisasi dan enzim diekstraksi dengan air selama 24 jam. Ekstrak air disentrifugasi, diikuti dengan fraksinasi protein dengan garam amonium sulfat, kemudian endapan amonium sulfat enzim dilarutkan dalam air suling dan dilakukan ultrafiltrasi pada filter Milipor PTGC 000 05 ditambahkan buffer fosfat 0,5 M (pH 8). ke filtrat yang dihasilkan dengan perbandingan 100 bagian buffer per 1 bagian filtrat dan dilewatkan melalui kolom dengan penukar ion DEAE-Sephadex A-50, kemudian di-ultrafilter secara berurutan pada Milipor PTGC 000 05, RTNK 000 05, PTGC 000 05 dan mengalami pengeringan beku.

Kerugian dari metode ini adalah hasil peroksidase yang tidak mencukupi, intensitas tenaga kerja yang tinggi dan lamanya proses.

Yang paling dekat adalah metode [Pat. RF 2130070, C12N 9/08, 10/05/1999], di mana akar lobak yang dicuci dengan air dikupas hingga 1/3 massanya dengan adanya larutan 0,25% asam askorbat food grade, digunakan sebagai larutan ekstraksi . Peroksidase hasil pemurnian diekstraksi selama 1 jam dengan larutan asam askorbat 0,25%, kemudian ekstrak disaring dan disentrifugasi. 5% natrium sulfit ditambahkan ke supernatan dan disimpan selama 24 jam pada suhu kamar untuk “mematangkan” enzim. Larutan enzim yang “matang” dikonsentrasikan pada peralatan serat ultrafiltrasi dengan filter yang memiliki diameter pori kurang dari 40 kDa. Amonium sulfat ditambahkan ke dalam larutan pekat 10 kali hingga kejenuhan akhir 85-90%, disentrifugasi, endapan dilarutkan dalam air suling ganda dengan volume sepuluh kali lipat dan dimasukkan ke dalam kolom yang diisi dengan Sephadex G-25, elusi dilakukan keluar dengan air suling ganda. Fraksi yang mengandung peroksidase dengan nilai R Z >0,1 dikumpulkan. Amonium sulfat ditambahkan ke fraksi yang dikumpulkan sampai kejenuhannya 85-90%, disentrifugasi, endapan dilarutkan dalam air sulingan dengan volume 3 kali lipat dan dimasukkan ke dalam kolom filtrasi gel yang diisi dengan Sephadex G-50, elusi dilakukan dengan air sulingan. Fraksi yang mengandung peroksidase dengan nilai R Z >0,5 dikumpulkan. Fraksi dicampur, dititrasi hingga pH 4,4 dan dimurnikan dengan karboksimetilselulosa, enzim dielusi dalam gradien konsentrasi dari 5 mM hingga 0,15 M buffer asetat (pH 4,4) (V=S-500 ml, R-500 ml). Fraksi dengan nilai R Z >2,7 dan konsentrasi enzim minimal 10 mg/ml dikumpulkan. Fraksi digabungkan, dititrasi sampai pH 5,0 dan dikeringkan beku.

Kerugian dari metode ini adalah kemurnian dan aktivitas yang kurang tinggi serta hasil peroksidase yang rendah.

Penemuan ini memecahkan masalah dalam menciptakan metode industri untuk memproduksi peroksidase dari akar lobak, yang memungkinkan diperolehnya peroksidase dengan kemurnian tinggi, aktivitas spesifik tinggi, dan hasil tinggi.

Masalahnya diselesaikan dengan metode untuk memperoleh enzim peroksidase dari akar lobak, yang meliputi penghancuran dan homogenisasi akar lobak yang bertunas, ekstraksi akar lobak yang dihomogenisasi, pemisahan protein pemberat dan pengendapan peroksidase dengan garam amonium sulfat, filtrasi gel peroksidase. larutan pada Sephadex, pemurnian kromatografi pada karboksimetilselulosa, pengeringan beku target peroksidase, sedangkan akar lobak yang dihancurkan diekstraksi dengan larutan natrium klorida 0,15±0,01 M dengan pH=4,4±0,2; filtrasi gel larutan peroksidase dilakukan pada Sephadex G-100 dengan elusi dengan larutan natrium klorida 0,15-0,2 M dengan pH 4,4-5,0, dialisis dilakukan terhadap buffer natrium asetat dengan pH 4,4-5,0 dan dialisis terhadap buffer kalium fosfat dengan pH 8,0±0,1 dan konsentrasi dengan pemurnian tambahan pada selulosa DEAE dengan elusi dengan buffer yang sama, dilanjutkan dengan dialisis terhadap air deionisasi.

Pengendapan protein dengan garam amonium sulfat digunakan dua kali: saturasi 45-48% digunakan untuk memisahkan protein pemberat, dan saturasi 85-90% digunakan untuk mengendapkan peroksidase,

Pemurnian kromatografi peroksidase pada karboksimetilselulosa diawali dengan dialisis terhadap buffer natrium asetat dengan pH 4,4-5,0.

Pengeringan beku didahului dengan dialisis larutan peroksidase terhadap air deionisasi.

Gambar 1 menunjukkan diagram skema isolasi peroksidase dari akar lobak.

Akar lobak dicuci dengan air mengalir dan dikecambahkan selama 140-160 jam pada suhu +25±1°C. Akar yang bertunas dihancurkan dan diekstraksi dengan larutan natrium klorida 0,15 M selama 12±2 jam sambil diaduk terus-menerus, kemudian disentrifugasi.

16,7±0,05 kg (saturasi 45-48%) amonium sulfat ditambahkan ke supernatan-1 (Gambar 1) dengan pengadukan terus menerus, endapan yang dihasilkan dipisahkan dengan sentrifugasi, dan 11 lainnya ditambahkan ke supernatan-2 yang dihasilkan (Gambar 1 .8±0,05 kg (saturasi 85%) amonium sulfat, endapan (Gambar 1) dipisahkan dengan sentrifugasi dan dilarutkan dengan air suling hingga volume akhir 200±10 ml. Setelah sentrifugasi, supernatan yang mengandung peroksidase dimasukkan ke dalam kolom yang diisi dengan Sephadex G-100 dan dielusi dengan larutan natrium klorida 0,15 M dengan kecepatan 100 ml/jam, dan fraksi 20 ml dikumpulkan selama elusi. R Z =D 408 /D 275 diukur dalam pecahan yang dikumpulkan. Fraksi yang R Znya tidak kurang dari 0,8 digabungkan dan didialisis dengan buffer natrium asetat (pH 4,4 ± 0,2) (buffer-1), kemudian larutan peroksidase yang telah dihilangkan garamnya dimasukkan ke dalam kolom berisi karboksimetilselulosa dan diseimbangkan dengan buffer-1, dan dielusi dengan gradien linier 5 mM - 0,1 M buffer asetat (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l). Nilai RZ diukur dalam fraksi protein. Fraksi yang nilai R Z minimal 2,5 digabungkan dan didialisis terhadap buffer kalium fosfat (pH 8,0 ± 0,1) (buffer 2), larutan enzim yang didialisis dilapiskan ke dalam kolom yang diisi dengan selulosa DEAE dan buffer-2 yang dielusi. Fraksi dengan nilai R Z minimal 3,0 dikumpulkan dan didialisis dengan air deionisasi, kemudian dipindahkan ke labu steril tahan panas dan dibekukan. nitrogen cair dan dikeringkan beku sampai sediaan benar-benar kering.

Ciri-ciri pembeda penting dari metode yang diusulkan untuk memperoleh secara biologis zat aktif adalah:

Penggunaan filtrasi gel pada Sephadex G-100 untuk pemurnian peroksidase terlengkap dari pengotor dengan berat molekul rendah;

Dialisis terhadap buffer natrium asetat (pH 4,4-5,0), yang memungkinkan Anda menghilangkan garam larutan peroksidase dan menyiapkannya untuk kromatografi pada karboksimetilselulosa;

Dialisis terhadap buffer kalium fosfat (pH 8,0±0,1), yang memungkinkan larutan peroksidase diubah menjadi buffer optimal dengan pH optimal untuk aplikasi pada selulosa DEAE;

Kromatografi penukar ion peroksidase pada DEAE-selulosa sebagai teknik yang tidak hanya memberikan pemurnian tambahan, tetapi juga konsentrasi larutan enzim.

Demikian, kami menawarkan pendekatan baru, memungkinkan pengolahan akar lobak menghasilkan enzim peroksidase kemurnian tinggi dan aktivitas tertentu.

Perbedaan antara metode yang diusulkan dan analog serta prototipe terdekat adalah sebagai berikut.

Dalam metode yang diusulkan, akar lobak yang dihancurkan diekstraksi dengan larutan natrium klorida 0,15±0,01 M dengan pH=4,4±0,2, sehingga mencapai transfer enzim yang paling lengkap ke dalam larutan, dan pada saat yang sama enzim tidak kehilangan konsentrasinya. aktivitas.

Dalam analogi dengan penemuan [Pat. RF 2130070, C12N 9/08, 10/05/1999] peroksidase dari pemurnian (tanpa homogenisasi!) diekstraksi selama 1 jam dengan larutan asam askorbat makanan 0,25%, yang dapat mempengaruhi hasil peroksidase, karena pemurnian tidak dihomogenisasi , dan oleh karena itu enzim tidak sepenuhnya masuk ke dalam larutan; ekstraksi terjadi dalam kondisi asam, yang dapat menyebabkan inaktivasi sebagian enzim. Dalam prototipe penemuan [A.S. Bulgaria 46675, C12N 9/08, 15/02/90] enzim dari homogenisasi akar lobak diekstraksi dengan air, yang juga menyebabkan rendahnya hasil peroksidase dari homogenisasi ke dalam larutan.

Berbeda dengan analog dari penemuan ini, dimana peroksidase diendapkan dua kali dengan saturasi 85-90% dengan amonium sulfat, dan prototipe penemuan ini, dimana protein diendapkan dengan garam amonium sulfat empat kali, dalam metode yang diklaim, protein pemberat dipisahkan dengan saturasi 45-48%, kemudian peroksidase diendapkan dengan saturasi 85%.

Dalam analog dan prototipe dari penemuan ini, konsentrasi dilakukan dengan ultrafiltrasi, sedangkan dalam analog dari penemuan ini, ultrafiltrasi mendahului pengendapan amonium sulfat peroksidase, yang mengarah ke kemungkinan besar kopresipitasi protein pengotor, dan, karenanya, kemurnian produk akhir yang lebih rendah. Dalam metode yang diusulkan, peroksidase dikonsentrasikan pada sorben penukar ion DEAE-selulosa pada tahap akhir proses teknologi, yang mengarah pada pemurnian tambahan enzim.

Dalam metode yang diusulkan, filtrasi gel dilakukan pada Sephadex G-100 dengan elusi dengan larutan natrium klorida 0,15±0,01 M (pH 4,4-5,0), yang memungkinkan Anda untuk sepenuhnya menghilangkan warna kehijauan dari larutan peroksidase karena adanya klorofil dan senyawa terkait, serta zat dengan ukuran molekul lebih kecil dari peroksidase. Dalam analogi penemuan ini, filtrasi gel dilakukan pada Sephadex G-25, yang lebih rendah daripada Sephadex G-100 dalam kemampuannya menahan partikel pengotor, dengan mempertimbangkan ukuran molekul peroksidase (sekitar 40 kDa).

Inti dari penemuan ini diilustrasikan oleh contoh-contoh berikut.

Contoh 1: Pembuatan ekstrak kasar

50 kg akar lobak dicuci dengan air mengalir dan dikecambahkan selama 140-160 jam pada suhu +25±1°C. Akar yang bertunas dihancurkan menggunakan paddle homogenizer dan diisi dengan 50 liter larutan natrium klorida 0,15-0,2 M (pH 4,4±0,2). Suspensi diekstraksi selama 12±2 jam dengan pengadukan konstan, kemudian disentrifugasi.

Amonium sulfat ditambahkan ke supernatan-1 dengan volume 60 liter untuk memisahkan protein pemberat sambil terus diaduk hingga jenuh 45-48%. (Yang kami maksud dengan saturasi 100% adalah jumlah garam yang pada saat penambahan larutan menjadi jenuh, dan setelah penambahan garam lebih lanjut, larutan menjadi lewat jenuh dan garam mengendap. Untuk larutan dengan amonium sulfat, saturasi 100% adalah penambahan dan penyelesaiannya. pelarutan 70,7 g amonium sulfat dalam 100 ml air suling.) Endapan-1 dipisahkan dengan sentrifugasi. Selanjutnya supernatan-2 yang dihasilkan dengan volume 55 l dijenuhkan dengan amonium sulfat hingga 85% untuk mengendapkan peroksidase, dan endapan-2 dipisahkan dengan sentrifugasi. Endapan-2 yang dihasilkan dilarutkan dengan air deionisasi hingga volume akhir 200±10 ml, endapan-3 yang tidak larut dipisahkan dengan sentrifugasi.

Kromatografi gel pada Sephadex G-100.

Larutan peroksidase diaplikasikan pada kolom 1 L yang diisi dengan Sephadex G-100. Elusi dilakukan dengan larutan natrium klorida 0,15-0,2 M (pH 4,4-5,0) dengan laju 100 ml/jam; selama elusi, fraksi 20 ml dipilih. R Z =D 408 /D 275 diukur dalam pecahan yang dikumpulkan. Pecahan yang R Znya paling sedikit 0,8 digabungkan.

5 liter buffer natrium asetat 5±0,1 mM (pH 4,4-5,0) (buffer-1) dan kantong dialisis dengan fraksi peroksidase gabungan ditempatkan dalam koleksi. Dialisis dilakukan dengan pengadukan konstan selama 24 jam, penggantian buffer dalam penampung sebanyak tiga kali.

Larutan enzim yang telah dihilangkan garamnya dimasukkan ke dalam kolom 1 L yang diisi dengan karboksimetilselulosa dan diseimbangkan dengan buffer-1. Elusi dilakukan dengan kecepatan 50 ml/jam dalam gradien linier 5 mM-0,1 M buffer asetat (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l). Nilai RZ diukur dalam fraksi protein. Pecahan yang nilai R Znya paling sedikit 2,5 digabungkan.

5 liter buffer kalium fosfat 20±0,1 mM (pH 8,0±0,1) (buffer-2) dan kantong dialisis dengan fraksi enzim gabungan ditempatkan dalam koleksi. Dialisis dilakukan dengan cara yang sama.

Mengkonsentrasikan kromatografi pada DEAE-selulosa.

Larutan enzim dengan pH 8,0 ± 0,1 dimasukkan ke dalam kolom 300 ml yang diisi selulosa DEAE. Elusi dilakukan dengan buffer-2 dengan kecepatan 50 ml/jam. Pecahan yang nilai R Znya paling sedikit 3,0 digabungkan.

5 liter air deionisasi dan kantong dialisis dengan larutan peroksidase ditempatkan dalam wadah. Dialisis dilakukan dengan cara yang sama.

Pengeringan beku.

Larutan peroksidase dipindahkan ke labu steril tahan panas, dibekukan dengan nitrogen cair dan dikeringkan beku sampai obat benar-benar kering.

Contoh 2 (perbandingan)

Pada contoh ini syarat untuk memperoleh peroksidase sesuai prototipe terpenuhi, namun untuk meningkatkan parameter utama peroksidase, dua tahapan yang ada pada prototipe diubah, yaitu: untuk konsentrasi ultrafiltrasi larutan peroksidase, dua jenis kolom dengan berongga serat digunakan, berbeda dengan prototipe, yang menggunakan satu jenis serat, dan fraksinasi fraksional protein dengan garam amonium sulfat (seperti dalam metode yang diklaim).

Memperoleh ekstrak kasar.

50 kg akar lobak dicuci dengan air mengalir dan dikupas hingga 1/3 massanya dengan adanya 33,5 liter larutan asam askorbat food grade 0,25%, di mana hasil pembersihan disimpan selama 1 jam untuk mengekstrak peroksidase. enzim. Selanjutnya ekstrak disentrifugasi dalam flow centrifuge dan disimpan selama 24 jam untuk “mematangkan” enzim.

Pemurnian dan konsentrasi primer.

1,7 kg (5% berat) natrium sulfit ditambahkan ke ekstrak yang dihasilkan dan ekstrak tersebut dikonsentrasikan dan pemurnian primer dengan ultrafiltrasi menggunakan instalasi dengan serat polimer berongga UPV-6, dilengkapi dengan kolom dengan filter yang memiliki ukuran pori 60 kDa dan 5 kDa. Diagram skematik pemasangannya ditunjukkan pada Gambar 2 yang menunjukkan pompa sentrifugal 1; prafilter 2; kolom dengan serat yang memiliki ukuran pori 60 kDa 3; kolom dengan serat mempunyai ukuran pori 5 kDa 4; peroksidase 5 filtrat; larutan terkonsentrasi peroksidase 6; filtrat yang mengandung protein dengan berat molekul rendah7.

Fraksinasi protein dengan garam amonium sulfat.

Amonium sulfat ditambahkan ke dalam konsentrat 6 liter untuk memisahkan protein pemberat sambil terus diaduk hingga jenuh 45-48%. Endapan dipisahkan dengan sentrifugasi. Selanjutnya supernatan yang dihasilkan dengan volume 5,7 liter untuk mengendapkan peroksidase dijenuhkan dengan amonium sulfat hingga 85%, endapan dipisahkan dengan cara sentrifugasi, yaitu dilarutkan dengan air suling ganda hingga volume akhir 200 ± 10 ml, tidak larut. endapan dipisahkan dengan sentrifugasi.

Kromatografi gel pada Sephadex G-25 dan G-50.

Pemurnian peroksidase lebih lanjut dilakukan pada kolom filtrasi gel yang diisi dengan Sephadex G-25 dan air sulingan yang diseimbangkan. Larutan peroksidase dioleskan ke kolom, elusi dilakukan dengan air suling. Kumpulkan pecahan yang R Znya tidak kurang dari 0,2. Amonium sulfat ditambahkan ke fraksi yang dikumpulkan sampai tercapai kejenuhan 90%, diaduk sampai garam benar-benar larut dan disentrifugasi. Endapan dilarutkan dalam 3 kali volume air sulingan dan dimasukkan ke dalam kolom filtrasi gel yang diisi dengan Sephadex G-50 dan diseimbangkan dengan air sulingan. Elusi dilakukan dengan air sulingan. Kumpulkan pecahan yang R Znya tidak kurang dari 0,6. Dengan 50% asam asetat nilai pH dalam fraksi dengan peroksidase ditetapkan pada 4,4.

Kromatografi pada karboksimetilselulosa.

Fraksi peroksidase dilapiskan ke dalam kolom 1 L yang diisi dengan karboksimetilselulosa, diseimbangkan sebelumnya dengan 5 mM buffer asetat pH 4,4. Elusi dilakukan dengan gradien linier 5 mM-0,15 M buffer asetat (pH 4,4±0,2) (V=S-0,5 l, R-0,5 l) selama 1 jam. Nilai RZ diukur dalam fraksi protein. Fraksi yang nilai R Znya tidak kurang dari 2,7 digabungkan, pH diatur hingga 5,0 dengan menambahkan amonia dan dikeringkan beku.

Data perbandingan untuk contoh 1 dan 2 diberikan dalam tabel.

Jadi, seperti dapat dilihat dari contoh dan tabel, metode yang diusulkan untuk memperoleh peroksidase dari akar lobak (contoh 1) memungkinkan untuk memperoleh peroksidase dengan hasil tinggi, dengan kemurnian dan aktivitas yang cukup untuk penggunaan enzim ini sebagai a komponen konjugat untuk uji imunosorben terkait-enzim. Dan dalam kondisi prototipe (contoh 2), bahkan dengan peningkatan dua tahap yang meningkatkan kinerja, hasil, aktivitas spesifik dan kemurnian target peroksidase lebih rendah dibandingkan dengan metode yang diusulkan.

Metode ini dapat digunakan di produksi industri peroksidase dari akar lobak.

MENGEKLAIM

1. Metode untuk memperoleh enzim peroksidase dari akar lobak, termasuk penghancuran dan homogenisasi akar lobak yang bertunas, ekstraksi homogenisasi akar lobak, pemisahan protein pemberat dan pengendapan peroksidase dengan garam amonium sulfat, filtrasi gel larutan peroksidase pada Sephadex, pemurnian kromatografi pada karboksimetilselulosa, pengeringan beku target peroksidase, ditandai dengan fakta bahwa akar lobak yang dihancurkan diekstraksi dengan larutan natrium klorida 0,15±0,01 M; Filtrasi gel larutan peroksidase dilakukan pada Sephadex G-100, dialisis dilakukan terhadap buffer natrium asetat dengan pH 4,4-5,0 dan dialisis terhadap buffer kalium fosfat dengan pH 8,0±0,1, dan konsentrasi dengan pemurnian tambahan pada DEAE -selulosa dengan elusi dengan buffer yang sama diikuti dengan dialisis terhadap air deionisasi.

2. Metode menurut klaim 1, dicirikan bahwa akar lobak yang dihancurkan diekstraksi dengan larutan natrium klorida 0,15±0,01 M dengan pH 4,4±0,2.

3. Metode menurut klaim 1, dicirikan bahwa pengendapan protein dengan garam amonium sulfat digunakan dua kali: saturasi 45-48% digunakan untuk memisahkan protein pemberat, dan saturasi 85-90% digunakan untuk mengendapkan peroksidase.

4. Metode menurut klaim 1, ditandai dengan filtrasi gel dilakukan pada Sephadex G-100 dengan elusi dengan larutan natrium klorida 0,15-0,2 M dengan pH 4,4-5,0.

5. Metode menurut klaim 1, dicirikan bahwa pemurnian kromatografi peroksidase pada karboksimetilselulosa didahului dengan dialisis terhadap buffer natrium asetat dengan pH 4,4-5,0.

6. Metode menurut klaim 1, ditandai dengan pengeringan beku yang didahului dengan dialisis larutan peroksidase terhadap air deionisasi.

yakh di antara mereka [Voronova et al., 1981]. Penggunaan metode penelitian kromatografi memungkinkan untuk mengisolasi dua protein dengan aktivitas peroksidase dan mempelajari beberapa sifat katalitiknya dalam eksperimen dan kontrol [Andreeva et al., 1979; Andreeva, 1981]. Ini memungkinkan untuk mendapatkannya informasi baru pada aktivitas isoperoksidase pada tanaman virus.

Dari karya yang diterbitkan Akhir-akhir ini, perhatian terbesar layak mendapatkan karya kolektif dari penulis “Biokimia imunitas, dormansi, penuaan tanaman”, yang dilakukan di Institut Biokimia yang dinamai demikian. SEBUAH.N.Bach. Mempelajari sisi yang berbeda metabolisme tanaman yang terkena penyakit jamur, penulis memberikan analisis berbagai penginduksi biotik pada reaksi pertahanan tanaman dan kemungkinan jalurnya penggunaan praktis. Namun tidak menganalisis informasi tentang biokimia reaksi pertahanan tanaman yang terinfeksi virus. Interaksi antara tanaman inang dan virus yang menginfeksinya terjadi secara berbeda dibandingkan saat terinfeksi jamur dan bakteri, karena virus tidak melakukannya

sistem enzim sendiri. Virus menginduksi proses dalam sel tumbuhan* yang sepenuhnya bergantung pada jalur metabolisme inang. Selain itu, virus yang sama juga dapat menyebabkan reaksi yang berbeda Mereka mempunyai inang yang berbeda, dan virus yang berbeda mempunyai reaksi yang tidak sama pada inang yang sama. Saat ini, kami memiliki, sebagai suatu peraturan, bahan tersebar yang diperoleh dari tanaman inang pada berbagai waktu infeksi dan pengambilan sampel untuk percobaan. Para peneliti mengidentifikasi reaksi metabolisme individu dan, berdasarkan reaksi tersebut, mencoba memahami interaksi virus-tanaman. Tentu saja, sangat penting untuk melakukan penelitian pada tanaman inang yang sama yang terkena penyakit virus dan jamur untuk memahami dengan jelas pola umumnya! perbedaan dan perbedaan tertentu dalam jalur proses kekebalan tanaman yang terinfeksi.

Praktik pertanian modern (menabur benih dari satu varietas di lahan yang luas, menggunakan fungisida, insektisida, dll.) berkontribusi pada munculnya ras patogen baru yang dapat menginfeksi varietas tanaman yang sebelumnya resisten. Jika pada tahun-tahun sebelumnya varietas dapat bertahan selama 2-3 dekade, kini ketahanan terhadap patogen hilang setelah 5-7 tahun [Konarev, 1985]. Dalam kondisi budidaya tanaman industri, strain virus yang sangat mematikan dapat diisolasi dan diakumulasikan dari populasi alami, menginfeksi tanaman yang ditanam secara terus-menerus. Semua ini menentukan perlunya studi mendalam tentang dasar biokimia dari mekanisme fitoimunitas, dan hasil yang diperoleh perkembangan teoritis lebih efektif digunakan untuk metode memerangi dan melindungi tanaman dari patogen.

Penulis mengucapkan terima kasih yang tulus kepada staf Pacific Institute kimia bioorganik Akademi Ilmu Pengetahuan Uni Soviet Cabang Timur Jauh kepada kandidat ilmu kimia Oleg Borisovich Maksimov, Raisa Petrovna Gorshkova dan Nina Arvidovna Vasilevskaya atas nasihat dan bantuannya dalam melaksanakan pekerjaan penentuan karbohidrat dan senyawa fenolik, serta Svetlana Ilyinichna Omelchenko, yang dihosting Partisipasi aktif dalam melakukan penelitian bersama.

PEROKSIDASE - OBJEK PENELITIAN

1.1. SEJARAH STUDI ENZIM

Manifestasi fungsi peroksidase dalam objek biologis telah diketahui pada abad terakhir, pada awal studi tentang zat organik. Laporan paling awal mengenai peroksidase muncul pada tahun 1855, setelah Schönbein melakukan oksidasi seri peroksidase. senyawa organik larutan encer peroksida dan adanya ekstrak dari tumbuhan dan hewan. Nama “peroksidase” diberikan oleh Linozier untuk enzim yang diisolasinya dari leukosit yang mengalami lisis nanah dan mengkatalisis oksidasi. koneksi yang berbeda karena oksigen peroksida (Linossier, 1898, dikutip [Mikhlin, 1947]). Linozier adalah orang pertama yang membedakan antara "oksidase" dan "peroksidase". Seperti yang ditulis D. M. Mikhlin, pelepasan peroksidase secara relatif bentuk murni dan kami berhutang studi tentang sifat dasarnya kepada Alexei Nikolaevich Bach dan kolaboratornya. Pada tahun 1903, mereka mengisolasi peroksidase, yang relatif bebas dari enzim lain (termasuk katalase), yang akhirnya terbantahkan. untuk waktu yang lama pendapat umum tentang identitas peroksidase dan katalase.

A. N. Bach dan R. Shoda menggunakan oksidasi pirogalol menjadi gallin berwarna ungu untuk mengevaluasi aktivitas peroksidase tanaman (Bach, Shodat, 1903, dikutip dalam: [Rogovin et al., 1977]). Mereka menemukan bahwa laju pembentukan purpurogalin sebanding dengan konsentrasi enzim dan hidrogen peroksida. Metode ini masih digunakan oleh ahli biokimia untuk menilai aktivitas peroksidase tumbuhan dan hewan. DI DALAM penelitian lebih lanjut aksi optimal peroksidase, ketergantungan suhu, konsentrasi ion hidrogen optimal, nilai konsentrasi substrat dalam reaksi dengan enzim, dll. juga ditetapkan untuk tingkat penelitian pada tahun-tahun itu melangkah maju dalam bidang mempelajari enzim protein tanaman. Saat itulah A. N. Bach mengajukan hipotesis tentang partisipasi peroksida dalam oksidasi senyawa organik.

Selama bertahun-tahun, minat terhadap enzim peroksidase tidak berkurang. Pada tahun 1930-an dan 1950-an, perhatian banyak peneliti terfokus pada protein hemin seperti peroksidase, katalase, sitokrom, dan hemoglobin. Hal ini ditegaskan oleh karya D. M. Mikhlin “Peroxides and Peroxidases”, yang diterbitkan pada tahun 1947. Pada tahun 60-70an, banyak perhatian diberikan pada peroksidase tanaman yang sakit di Departemen Fisiologi.

tanaman Universitas Negeri Moskow oleh anggota koresponden VASKhNIL B. A. Rubin dan stafnya. Pada tahun 80-an, di Departemen Enzimologi Kimia Universitas Negeri Moskow, dipimpin oleh Anggota Koresponden dari Akademi Ilmu Pengetahuan Uni Soviet I.V. Bere! Zin, sifat katalitik peroksidase berhasil dipelajari ya! dipisahkan dari tanaman lobak. Menurut ringkasan literatur yang disajikan oleh peneliti Swiss dan Kanada, 1.600 buku diterbitkan antara tahun 1970 dan 1980 saja. artikel ilmiah didedikasikan untuk enzim ini. Mereka menyoroti berbagai aspek struktur fisikokimia, tindakan biologis dan partisipasi dalam proses metabolisme peroksidase, terutama asal tumbuhan. Daftar karya yang disajikan oleh penulis tidak lengkap, karena karya mengenai peroksidase mikroorganisme dan makroorganisme tidak diperhitungkan.

Meningkatnya perhatian terhadap enzim ini terutama disebabkan oleh fakta bahwa keberadaan sejumlah besar isoenzim (dari 3 hingga 42) dalam banyak peroksidase tanaman yang diteliti masih belum jelas. Skandaliosis menganggap peroksidase sebagai “keluarga” enzim dengan sifat fisiologis dan biokimia yang serupa, namun masih banyak yang harus dijelaskan. Lainnya, tidak kurang minat Tanya terletak pada kekhususan substrat yang luas atau, dalam arti sempit definisi ini, tidak adanya kekhususan untuk peroksidase. Telah ditetapkan bahwa peroksidase tidak spesifik dalam kaitannya dengan donor hidrogen, tetapi sangat spesifik dalam kaitannya dengan substrat kedua - hidrogen peroksida ketika fungsi peroksidase enzim diwujudkan. Kemungkinan keterlibatan peroksidase dalam reaksi defensif atau dalam manifestasi patogenesis lainnya juga berkontribusi terhadap perhatian terus-menerus para peneliti terhadap enzim ini.

1.2. FITUR STRUKTUR MOLEKUL

Peroksidase adalah enzim dua komponen yang merupakan kombinasi gugus aktif yang melakukan interaksi kimia dengan substrat dan “pembawa” protein koloid yang meningkatkan efek katalitik gugus ini. Ini adalah protein globular dengan diameter 50 A, yang mengandung sekitar 43% daerah heliks a di bagian protein molekul. Menurut tata nama enzim yang diadopsi pada Kongres Biokimia Internasional pada tahun 1979, peroksidase adalah enzim yang bekerja pada hidrogen peroksida sebagai akseptor. Satu-satunya subkelas (1.11.1) terdiri dari peroksidase, dengan kode nomor tujuh adalah donor peroksidase sebenarnya: Hr Cl oksidoreduktase (EC 1.11.1.7), yang tindakan katalitiknya akan dibahas lebih rinci di bawah.

Peroksidase yang dipelajari sejauh ini terdiri dari glikoprotein tidak berwarna dan ferriporphyrin berwarna coklat-merah yang terkait dengannya. Bagian hemin dari molekul (heme, hemin)-besi protopor-phyrin IX ditunjukkan pada Gambar. 1. Bertindak sebagai pusat aktif, ia berpartisipasi dalam penguraian atau aktivasi hidrogen peroksida, yang mengakibatkan pembentukan radikal pada substrat yang sesuai. Kelompok prostetik peroksidase lobak pedas dan lobak Jepang, sitokrom c, dan kloroperoksidase dikenal sebagai ferriprotoporphyrin IX. Semua peroksidase yang diketahui dan isoformnya diyakini mengandung heme ini, karena dihambat oleh azida dan sianida.

Peroksidase

Glikoprotein Protohematin IX

Fe3* Protoporfirin IX

Ferriprotoporphyrin IX termasuk dalam pusat aktif, membentuk cincin porfirin heme, yang merupakan senyawa sangat aromatik dan hidrofobik. Ini adalah interaksi hidrofobik dari siklus makro porfirin dengan protein yang terbentuk struktur tersier peroksidase asli. Diketahui bahwa protoporphyrin memiliki efek stabilisasi yang penting pada gumpalan protein enzim yang mengandung heme. Dengan demikian, pembentukan kompleks apoperoksidase lobak dengan hemin secara tajam meningkatkan ketahanan protein terhadap radiasi ultraviolet dan panas. Penghapusan prostetik

kelompok enzim menyebabkan hilangnya aktivitas peroksidase, tetapi tidak mempengaruhi fungsi oksidasenya.

Hill dan Holden pada tahun 1926 adalah orang pertama yang berhasil memecah molekul peroksidase menjadi gugus prostetik dan protein menggunakan perlakuan tersebut. asam hidroklorik dan aseton. Maeli, dengan menggunakan berbagai metode hidrolisis basa dan asam dari ikatan heme-protein, menunjukkan bahwa ketika HCA dinetralkan dengan alkali dalam larutan pembelahan dengan adanya buffer yang sesuai, terjadi rekombinasi protohemin dan protein menjadi peroksidase aktif] Dan ini reaksi reversibel dapat diulangi beberapa kali dengan enzim yang sama tanpa kehilangan aktivitas yang nyata. Penulis juga mencatat bahwa protein peroksidase lobak stabil pada pH basa, dan warnanya stabil

Proses kompleks terus menerus terjadi pada sel tumbuhan dan hewan. proses kimia. Mereka diatur oleh protein - enzim yang berperan katalis reaksi kimia dalam sel. Untuk mempelajarinya proses biokimia instrumen yang kompleks dan banyak reagen diperlukan. Namun, beberapa fenomena biokimia dapat diamati, katanya, dengan mata telanjang.

Mari kita mulai dengan enzim oksidatif - oksidase dan peroksidase. Mereka terdapat di banyak jaringan hidup karena oksidasi mendasari proses respirasi. Tetapi enzim-enzim ini bertindak berbeda: oksidase mengoksidasi bahan organik oksigen dari udara, peroksidase “mengekstraksi” oksigen dari peroksida untuk tujuan yang sama. Tentu saja, zat teroksidasi secara perlahan bahkan tanpa bantuan enzim, tetapi enzim mempercepat reaksi ribuan kali lipat.

Ketika beberapa zat, seperti fenol dan hidrokuinon, dioksidasi, produk reaksi berwarna akan terbentuk. Munculnya warna menandakan bahwa enzim telah bekerja. Dan intensitas warna memungkinkan kita menilai jumlah produk oksidasi. Jika tidak muncul warna sama sekali, maka enzim tersebut tidak aktif. Hal ini dapat terjadi di lingkungan yang terlalu asam atau terlalu basa, atau jika tidak ada pemasok oksigen, atau jika terdapat zat berbahaya bagi enzim - yang disebut penghambat enzim.

Setelah perkenalan singkat ini - eksperimen itu sendiri. Anda membutuhkan: batang kubis, apel, umbi kentang dengan kecambah, bawang bombay dengan akar, bertunas dalam gelap. Reagennya adalah air rebusan dingin, atau lebih baik lagi, air suling, hidrokuinon (dari toko foto) dan hidrogen peroksida farmasi. Siapkan juga parutan sayur, penangas air, tabung reaksi atau botol penisilin, pipet bersih dan kain kasa atau kain putih.

Mari kita mulai penelitian kita dengan jus kubis. Giling sepotong batang kubis, sekitar 20 g, peras ampas yang dihasilkan melalui dua lapis kain kasa atau satu lapis kain, kumpulkan jus dalam gelas dan encerkan sepuluh kali dengan air. Kami segera memperingatkan Anda: saat mempelajari objek tanaman lain, jus harus diencerkan tidak lebih dari dua hingga tiga kali.

Nomor enam tabung atau botol reaksi yang bersih dan kering. Tuang 1 ml sari kubis encer ke dalam tabung reaksi No. 1, 2, 3 dan 4. Masukkan tabung reaksi 1 dan 2 ke dalam penangas air mendidih selama lima menit untuk menghancurkan (menonaktifkan) enzim, kemudian dinginkan hingga suhu kamar. Sebagai pengganti jus, tuangkan 1 ml air ke dalam tabung reaksi 5 dan 6.

Tambahkan sedikit hidrokuinon ke keenam tabung reaksi dengan menggunakan ujung pisau. Kemudian tuangkan lima tetes air ke dalam tabung reaksi 1, 3 dan 5, dan lima tetes hidrogen peroksida ke dalam tabung reaksi 2, 4 dan 6. Campurkan isi setiap tabung reaksi hingga merata.

Setelah 10-15 menit Anda sudah dapat mengamati hasil percobaannya. Kami sangat menyarankan Anda menuliskannya dalam bentuk tabel. Masukkan dalam tabel nomor tabung reaksi dan komposisi campuran pada masing-masing tabung; pada kolom di sebelah masing-masing campuran, tandai apakah warnanya berubah selama percobaan, dan jika berubah, lalu bagaimana tepatnya. Pada kolom berikutnya, simpulkan apakah telah terjadi oksidasi.

Ketika seluruh tabel sudah terisi, coba analisis hasilnya. Untuk melakukan ini, pikirkan pertanyaan-pertanyaan ini.

Bisakah hidrogen peroksida mengoksidasi hidrokuinon tanpa adanya jus kubis?

Apakah hidrokuinon teroksidasi oleh jus kubis tanpa hidrogen peroksida?

Apakah aktivitas enzim dipertahankan dalam jus setelah direbus?

Enzim oksidatif apa yang terkandung dalam jus kubis - oksidase atau peroksidase?

Namun, berdasarkan pengalaman dengan tumbuhan dari spesies yang sama, masih terlalu dini untuk menarik kesimpulan akhir. Oleh karena itu, lakukan percobaan yang sama dengan umbi kentang dan kecambahnya, dengan daging buah apel, dengan sisik bawang yang berdaging, serta dengan bagian bawah dan daunnya (“bulu”). Kami mengingatkan Anda: dalam kasus ini, jus yang dihasilkan harus diencerkan dengan air 2-3 kali.

Ketika semua percobaan telah selesai, dimungkinkan untuk menentukan bahan mana yang mempelajari enzim oksidatif yang lebih aktif. Menurut Anda apakah oksidase dan peroksidase dapat terdapat secara bersamaan di jaringan tumbuhan?

Cobalah mengambil kesimpulan sendiri tanpa melihat penjelasannya. Dan ketika kesimpulan sudah dibuat, periksa seberapa benar kesimpulan tersebut.

Kesimpulan satu. Hidrogen peroksida secara bertahap dapat mengoksidasi hidrokuinon bahkan tanpa jus: warna merah muda perlahan muncul di tabung reaksi 5 dan 6. Artinya enzim tidak diperlukan untuk reaksi. Seperti semua katalis, enzim hanya mempercepat reaksi yang telah dimulai berkali-kali lipat. Tentu saja Anda memperhatikan betapa cepatnya warna muncul di tabung reaksi 4. Namun, peroksidase tidak dapat mempercepat reaksi hidrokuinon dengan oksigen atmosfer (warna di tabung reaksi 3 tidak ada atau muncul sangat lambat).

Kesimpulan kedua. Enzim ini dapat dinonaktifkan bahkan dengan perebusan jangka pendek. Pada tabung reaksi 2 praktis tidak ada pewarna. Bagaimanapun, enzim adalah protein; mereka menggumpal ketika dipanaskan - serpihan protein muncul di tabung reaksi 1 dan 2.

Kesimpulan ketiga. Pada tabung reaksi 3 tidak muncul warna. Artinya jus kubis hanya mengandung peroksidase, yang mempercepat oksidasi hidrokuinon hanya dengan adanya hidrogen peroksida. Namun, dalam percobaan dengan umbi kentang dan apel, warna muncul, dan terutama dengan cepat saat botol dikocok, saat larutan diperkaya dengan oksigen. Artinya kentang dan apel mengandung oksidase (lebih khusus lagi, fenol oksidase) yang mendorong oksidasi hidrokuinon dengan oksigen. Inilah sebabnya mengapa potongan umbi kentang dan apel menjadi gelap di udara - mengandung zat yang berhubungan dengan hidrokuinon. Oksidase juga kehilangan aktivitas saat dipanaskan. Ingat, apakah kentang rebus menjadi gelap?

Akhirnya, kesimpulan keempat . Kentang dan apel juga mengandung oksidase - ketika peroksida ditambahkan ke tabung reaksi 4, warnanya muncul lebih cepat. Tapi tidak ada oksidase di sisik bawang yang berdaging. Mereka tidak menjadi gelap di udara bahkan dengan hidrokuinon.

Ngomong-ngomong, pernahkah Anda memperhatikan bahwa enzim oksidatif sangat aktif pada organ tanaman yang bersiap untuk pertumbuhan atau pertumbuhan - di bagian bawah bawang merah dan akarnya, di kecambah umbi kentang? Metabolisme terjadi paling intensif di sana.

Jadi, kami menemukan bahwa tidak semua kondisi lingkungan mendukung kerja enzim. Jika panas tinggi menonaktifkan enzim, mungkinkah enzim lebih aktif pada suhu rendah? Mari kita periksa ini juga. Untuk percobaannya, Anda memerlukan tambahan empat toples kaca atau logam dengan kapasitas sekitar satu liter dan es atau salju (sekitar 1 kg). Mari bereksperimen dengan batang kubis.

Parut batangnya, peras sarinya, seperti sebelumnya, melalui kain kasa atau kain dan encerkan dengan air dua puluh kali. Beri nomor ulang pada tabung reaksi jika penomoran lama terhapus karena alasan tertentu, dan tuangkan 1 ml jus kubis encer ke dalam tabung reaksi 1, 2, 3 dan 4, lalu tambahkan hidrokuinon di ujung pisau. Sebagai pengganti jus, tuangkan 1 ml air ke dalam tabung reaksi 5 dan 6 dan tambahkan juga hidrokuinon. Dan kemudian susun tabung reaksi sebagai berikut: 1 - dalam toples berisi salju atau es; 2 - dalam toples berisi air hangat (40°C); 3 - dalam toples dengan air panas(60°C); 4 - biarkan di atas meja pada suhu kamar; 5 - ke dalam toples berisi air mendidih; 6 - biarkan pada suhu kamar.

5 menit setelah percobaan dimulai, tuangkan lima tetes hidrogen peroksida ke dalam semua tabung reaksi, dimulai dari tabung yang lebih dingin. Kocok campuran dengan hati-hati dan perhatikan waktu dimulainya reaksi. Setelah 5 menit berikutnya, keluarkan tabung reaksi dari toples dan tuliskan hasil percobaan dalam bentuk tabel, kurang lebih sama seperti terakhir kali. Ketika tabel sudah selesai, Anda dapat mulai menganalisis data yang diperoleh.

Cobalah menarik kesimpulan Anda sendiri dengan terlebih dahulu menjawab pertanyaan-pertanyaan berikut.

Apakah reaksi oksidasi semakin cepat seiring dengan kenaikan suhu tanpa penambahan enzim?

Dapatkah kita mengatakan bahwa enzim bekerja lebih baik bila didinginkan?

Berapa suhu yang paling menguntungkan untuk kerja peroksidase?

Mengapa produk makanan Apakah bisa bertahan lebih lama di lemari es?

Mengapa susu direbus?

Mengapa hewan berdarah panas - mamalia dan burung - merupakan hewan yang paling berkembang dan dapat bertahan hidup di Bumi?

Sudahkah Anda menjawab semua pertanyaan ini? Berikut penjelasan kami.

Anda mungkin telah memperhatikan bahwa laju oksidasi hidrokuinon oleh hidrogen peroksida tidak sama pada suhu rendah dan tinggi. Pada suhu tinggi, laju oksidasi secara alami lebih tinggi. Peroksidase memfasilitasi interaksi hidrokuinon dengan peroksida. Dengan adanya enzim, reaksi terjadi meskipun pada suhu rendah, namun semakin tinggi suhu maka semakin mudah enzim mengaktifkan molekul zat yang bereaksi.

Namun kita tidak boleh lupa bahwa protein menggumpal pada suhu tinggi dan laju reaksi menurun. Ada konsep suhu optimal untuk kerja enzim, di mana enzim paling aktif. Suhu ini tidak sama untuk enzim yang berbeda, tetapi banyak enzim, termasuk peroksidase, memiliki suhu optimum 40-50°C.

Produk makanan rusak karena pengaruh enzim yang dikandungnya atau disekresikan oleh mikroorganisme. Dalam cuaca dingin, aktivitas enzim menurun - itulah sebabnya makanan lebih sedikit rusak di lemari es.

Pada tahap atas evolusi telah berevolusi menjadi hewan berdarah panas yang dapat menjaga suhu tubuh yang optimal untuk aktivitas enzim.

O. Holguin. "Eksperimen tanpa ledakan"
M., "Kimia", 1986

PEROKSIDASE- sekelompok enzim redoks (EC 1.11.1.1 - 1.11.1.10) menggunakan hidrogen peroksida (H 2 O 2) sebagai akseptor elektron; mengkatalisis reaksi:

Biol, pentingnya P. ditentukan oleh partisipasinya dalam oksidasi berbagai substrat pada membran mitokondria dan mikrosom. Substrat biol utama tanaman P. adalah polifenol (lihat). Dengan mengkatalisis oksidasi polifenol dengan partisipasi H 2 O 2, polifenol berperan dalam proses respirasi sel tumbuhan. Pada hewan dan manusia, P. juga mengambil bagian dalam sejumlah proses oksidatif yang terjadi di jaringan. Jadi, P. dengan adanya H 2 O 2 mengkatalisis oksidasi adrenalin, histamin, yang berlemak, nukleotida, iodida. Yodium yang terbentuk sebagai hasil oksidasi peroksidase ion iodida digunakan dalam proses sintesis hormon tiroid - tiroksin. P. kelenjar tiroid, selain oksidasi iodida, juga mengkatalisis pengikatan kovalen residu diiodotyrosine, yang mengarah pada pembentukan tiroksin. Laktoperoksidase dan P. leukosit mengkatalisis peroksidasi lipid dengan adanya H 2 O 2 dan 1~. Sistem seperti ini diyakini memberikan aktivitas antimikroba pada susu, air liur, dan leukosit polimorfonuklear. Derajat aktivitas P. dalam leukosit berfungsi sebagai tes tambahan dalam diagnosis leukemia myeloblastik akut. P. air liur memainkan peran tertentu dalam patogenesis penyakit periodontal. Penentuan aktivitas P. dalam air liur digunakan sebagai tes tambahan dalam diagnosis penyakit periodontal dan untuk memantau efektivitas terapinya.

Jaringan hewan mengandung glutathione peroksidase aktif. Di hati, kerja enzim ini dikaitkan dengan penghancuran H 2 O 2, yang terbentuk sebagai hasil aktivitas berbagai oksidase. Reaksi yang dikatalisis oleh glutathione peroksidase melibatkan oksidasi glukosa-6-fosfat dan reduksi simultan glutathione teroksidasi yang terbentuk selama reduksi H 2 O 2 dalam reaksi peroksidase. Oksidasi bentuk tereduksi nukleotida piridin oleh sistem O 2 -Mn 2+ -Peroksidase dijelaskan.

P. digunakan untuk analisis klinis dan biokimia sebagai salah satu komponen campuran reaksi dalam menentukan kandungan glukosa dalam biol, cairan menggunakan metode glukosa oksidase (lihat metode Gorodetsky).

Reaksi peroksidase ditemukan pada tahun 1855 oleh Ch. F. Schonbein, dan nama kelompok enzim ini “peroksidase” diusulkan pada tahun 1898 oleh M. Linossier.

P. tersebar luas pada hewan dan tumbuhan. DI DALAM jumlah besar mereka terkandung dalam akar lobak dan lobak, dalam jus susu dari pohon ara. Pada hewan, P. terdapat dalam susu, hati, mukosa usus, kelenjar ludah, leukosit, dan eritrosit.

Fis.-Kimia. dan biol, sifat-sifat P. telah dipelajari secara rinci dengan menggunakan contoh peroksidase dari akar lobak, yang diperoleh dalam bentuk kristal oleh X. Theorell pada tahun 1941.

P. adalah hemoprotein dengan mol. penimbangan (massa) dari 40.000 hingga 100.000. Kemungkinan pemisahan apoenzim dari kelompok prostetik, yaitu protohematin, telah ditunjukkan. Penambahan protohematin murni ke apoenzim P. menyebabkan pemulihan aktivitas enzim yang hampir sempurna. Telah ditetapkan bahwa selama reaksi peroksidase, substrat teroksidasi melekat langsung ke atom besi dari gugus prostetik enzim. Hemoglobin juga memiliki aktivitas peroksidase (walaupun relatif lemah); properti ini digunakan untuk penentuan cepat keberadaan darah atau hemoglobin, misalnya dalam urin, serta identifikasi jejak darah dalam kedokteran forensik. praktik.

Larutan P. murni mempunyai karakteristik serapan maksimum pada daerah spektrum tampak pada 645, 583, 548 dan 498 nm.

P. menunjukkan spesifisitas yang tinggi untuk gugus peroksida dan dalam banyak kasus kurang spesifik dibandingkan dengan donor hidrogen (dengan pengecualian bakteri P. dan peroksidase dari kacang tanah). Dengan tidak adanya donor hidrogen (substrat yang dapat teroksidasi), enzim membentuk kompleks dengan H 2 O 2, yang disertai dengan perubahan spektrum serapan enzim. P. membentuk empat jenis kompleks dengan H 2 O 2 yang mudah dideteksi secara spektrofotometri (lihat Spektrofotometri). Kompleks I terbentuk segera setelah penambahan H 2 O 2 ke enzim dan merupakan senyawa hijau tidak stabil, yang biasanya dengan cepat berubah menjadi kompleks II berwarna merah muda. Dengan kelebihan H 2 O 2, terbentuk kompleks III dan IV - senyawa berwarna merah tua. Kompleks ini tidak aktif secara katalitik; pembentukannya menyebabkan aktivasi gen enzim.

P. relatif termostabil. Pada konsentrasi rendah mereka dihambat oleh apa yang disebut. racun pernafasan (sianida, azida, sulfida) yang mengikat besi pada gugus hemin P., serta hidroksilamina, tiourea, dan oksida nitrat.

Aktivitas P. dapat ditentukan oleh jumlah pirogalol (lihat) yang dioksidasi oleh H 2 O 2 dengan adanya enzim. Produk oksidasi pirogalol, purpurogallin, diekstraksi setelah pengendapan protein dari campuran inkubasi dengan eter dan ditentukan secara fotometrik. Aktivitas P. dinilai dari jumlah purpurogallin (bilangan pur-nurogalline) yang dihitung yang terbentuk di bawah aksi 1 mg kering persiapan enzim dalam waktu 5 menit. pada suhu 20° dari 5 g pirogalol dilarutkan dalam 2 liter air yang mengandung 10 ml larutan H 2 O 2 0,5%.

Bibliografi: Barabash R.D. dkk. Peran peroksidase dalam patogenesis penyakit periodontal, Vopr. Sayang. khim., t.25, no.3, hal. 333, 1979; Dixon M. dan U e b b E. Enzim, trans. dari bahasa Inggris, hal. 96 dan lain-lain, M., 1966; Tata nama enzim, trans. dari bahasa Inggris, ed. AE Braunstein, hal. 75, M., 1979.

I.V. Verevkina.