Пероксидаза в каких продуктах содержится. Большая энциклопедия нефти и газа. Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена

Способ предусматривает размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия. Отделяют балластные белки и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония 45-48% насыщения и 85-90% насыщения соответственно. Гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия. Хроматографическую очистку проводят на карбоксиметилцеллюлозе. Осуществляют лиофильную сушку целевой пероксидазы. Проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1. Осуществляют концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды. Способ позволяет получить пероксидазу с высокой удельной активностью и высоким выходом. Выход пероксидазы составляет 2,52-3,50 г/кг корней хрена, удельная активность - 640-700 Е.А./мг белка. 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

Рисунки к патенту РФ 2353652

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к производству ферментов из растительного сырья, и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства фермента пероксидазы из корней хрена для иммунологии и иммунохимии в качестве главной составной части конъюгатов для иммуноферментных анализов.

Известны различные способы получения пероксидазы из корней хрена .

Известен способ получения пероксидазы из корней хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента солевым раствором, осаждение фермента солями сульфата аммония, гельфильтрацию, спиртовое осаждение, электрофорез, переосаждение хлоридом аммония, фильтрацию через сефадекс G-50 и ДЭАЭ-целлюлозу и диализ .

Основными недостатками данного способа являются невысокая активность и чистота полученного продукта, а также сложность его получения и большое количество стадий технологического процесса.

Известен также способ получения пероксидазы из корней хрена, по которому корни хрена гомогенизируют, затем экстрагируют фермент водой и осаждают пероксидазу солями сульфата аммония с последующей гельфильтрацией [Пат. Венгрии 172872, C07G 7/022].

Недостатком данного способа является низкий выход и низкая чистота фермента.

Известен способ [А.С. Болгарии 46675, C12N 9/08, 15.02.90], по которому корни хрена проращивают в течение 2-3 суток, затем гомогенизируют и экстрагируют фермент водой в течение суток. Водный экстракт центрифугируют с последующим фракционированием белков солями сульфата аммония, затем сульфатаммонийный осадок фермента растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации на фильтрах "Милипор" PTGC 000 05. К полученному фильтрату прибавляют 0,5 М фосфатный буфер (рН 8) в соотношении 100 частей буфера на 1 часть фильтрата и пропускают через колонку с ионообменником ДЭАЭ-Сефадекс А-50, затем последовательно ультрафильтруют на "Милипор" PTGC 000 05, РТНК 000 05, PTGC 000 05 и подвергают лиофильной сушке.

Недостатком данного метода является недостаточно высокий выход пероксидазы, высокая трудоемкость и длительность процесса.

Наиболее близким является способ [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999], в котором промытые водой корни хрена зачищают на 1/3 массы в присутствии 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, используемого в качестве экстрагирующего раствора. Пероксидазу из очисток экстрагируют в течение 1 ч 0,25% раствором аскорбиновой кислоты, затем экстракт фильтруют и центрифугируют. К надосадочной жидкости добавляют 5% сульфита натрия и выдерживают в течение 24 ч при комнатной температуре для "созревания" фермента. "Созревший" раствор фермента концентрируют на ультрафильтрационных волоконных аппаратах с фильтрами, имеющими диаметр пор менее 40 кДа. К сконцентрированному в 10 раз раствору добавляют сульфат аммония до конечного насыщения 85-90%, центрифугируют, осадок растворяют в десятикратном объеме бидистиллированной воды и наносят на колонку, заполненную сефадексом G-25, элюцию проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу с величиной R Z >0,1. К собранным фракциям добавляют сульфат аммония до насыщения 85-90%, центрифугируют, осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненную сефадексом G-50, элюцию проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, содержащие пероксидазу, с величиной R Z >0,5. Фракции смешивают, дотитровывают до рН 4,4 и подвергают очистке на карбоксиметилцеллюлозе, фермент элюируют в градиенте концентраций от 5 мМ до 0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4) (V=S-500 мл, R-500 мл). Собирают фракции с величиной R Z >2,7 и с концентрацией фермента не менее 10 мг/мл. Фракции объединяют, дотитровывают до рН 5,0 и лиофильно высушивают.

Недостатками данного метода являются недостаточно высокая чистота и активность и небольшие выходы пероксидазы.

Изобретение решает задачу создания промышленного способа получения пероксидазы из корней хрена, позволяющего получать пероксидазу с высокой чистотой, с высокой удельной активностью и с высоким выходом.

Поставленная задача решается способом получения фермента пероксидазы из корней хрена, который включает размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена, отделение балластных белков и осаждение пероксидазы солями сульфата аммония, гельфильтрацию раствора пероксидазы на сефадексе, хроматографическую очистку на карбоксиметилцеллюлозе, лиофильную сушку целевой пероксидазы, при этом измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН=4,4±0,2; гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия с рН 4,4-5,0, проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1 и концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды.

Дважды используют осаждение белков солями сульфата аммония: для отделения балластных белков используют 45-48% насыщение, а для осаждения пероксидазы используют 85-90% насыщение,

Хроматографической очистке пероксидазы на карбоксиметилцеллюлозе предшествует диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0.

Лиофильной сушке предшествует диализ раствора пероксидазы против деионизованной воды.

На Фиг.1 приведена принципиальная схема выделения пероксидазы из корней хрена.

Корни хрена отмывают под проточной водой и проращивают в течение 140-160 ч при температуре +25±1°С. Пророщенные корни измельчают и экстрагируют 0,15 М раствором хлорида натрия в течение 12±2 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют.

К супернатанту-1 (Фиг.1) при непрерывном перемешивании добавляют 16,7±0,05 кг (45-48% насыщения) сульфата аммония, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а к образовавшемуся супернатанту-2 (Фиг.1) добавляют еще 11,8±0,05 кг (85% насыщения) сульфата аммония, осадок (Фиг.1) отделяют центрифугированием и растворяют дистиллированной водой до конечного объема 200±10 мл. После центрифугирования супернатант, содержащий пероксидазу, наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100, и элюируют 0,15 М раствором хлорида натрия со скоростью 100 мл/ч, в ходе элюции отбирают фракции по 20 мл. В собранных фракциях измеряют R Z =D 408 /D 275 . Фракции, в которых R Z не менее 0,8, объединяют и диализуют против натрий-ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (буфер-1), затем обессоленный раствор пероксидазы наслаивают на колонку, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную буфером-1, и элюируют линейным градиентом 5 мМ - 0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,5, объединяют и диализуют против калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2), отдиализованный раствор фермента наслаивают на колонку, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, и элюируют буфером-2. Фракции, в которых значение R Z не менее 3,0, объединяют и диализуют против деионизованной воды, затем переносят в стерильную термостойкую колбу, замораживают жидким азотом и лиофильно сушат до полного высыхания препарата.

Существенными отличительными признаками предлагаемого способа получения биологически активных веществ являются:

Использование гельфильтрации на сефадексе G-100 для максимально полной очистки пероксидазы от низкомолекулярных примесей;

Диализ против натрий-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0), позволяющий обессолить раствор пероксидазы и подготовить его к хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе;

Диализ против калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1), позволяющий перевести раствор пероксидазы в оптимальный буфер с оптимальным рН для нанесения на ДЭАЭ-целлюлозу;

Ионообменная хроматография пероксидазы на ДЭАЭ-целлюлозе как прием, обеспечивающий не только дополнительную очистку, но и концентрирование раствора фермента.

Таким образом, нами предлагается новый подход, позволяющий осуществлять переработку корней хрена с получением фермента пероксидазы высокой чистоты и удельной активности.

Отличие заявляемого способа от ближайшего аналога и прототипа состоит в следующем.

В заявляемом способе измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН=4,4±0,2, тем самым достигается максимально полный переход фермента в раствор, и при этом фермент не теряет своей активности.

В аналоге изобретения [Пат. РФ 2130070, C12N 9/08, 10.05.1999] пероксидазу из очисток (без гомогенизации!) экстрагируют в течение 1 ч 0,25% раствором пищевой аскорбиновой кислоты, что может сказываться на выходе пероксидазы, поскольку очистки не гомогенизируются, а следовательно, фермент переходит в раствор далеко не полностью, при этом экстракция протекает в кислых условиях, что может привести к частичной инактивации фермента. В прототипе изобретения [А.С. Болгарии 46675, C12N 9/08, 15.02.90] фермент из гомогенизата корней хрена экстрагируют водой, что также приводит к низкому выходу пероксидазы из гомогенизата в раствор.

В отличие от аналога изобретения, где пероксидазу осаждают дважды 85-90% насыщением сульфатом аммония, и прототипа изобретения, где четыре раза проводят осаждение белков солями сульфата аммония, в заявляемом способе проводят отделение балластных белков 45-48% насыщением, а затем осаждают пероксидазу 85% насыщением.

В аналоге и прототипе изобретения концентрирование проводят методом ультрафильтрации, при этом в аналоге изобретения ультрафильтрация предшествует сульфатаммонийному осаждению пероксидазы, что приводит к большой вероятности соосаждения примесных белков, а соответственно, к более низкой чистоте конечного продукта. В заявляемом способе пероксидаза подвергается концентрированию на ионообменном сорбенте ДЭАЭ-целлюлоза на заключительной стадии технологического процесса, что приводит и к дополнительной очистке фермента.

В заявляемом способе гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100 с элюированием 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия (рН 4,4-5,0), что позволяет полностью избавиться от зеленоватого оттенка раствора пероксидазы, обусловленного наличием хлорофилла и родственных соединений, и веществ с меньшим, чем у пероксидазы, размером молекул. В аналоге изобретения гельфильтрацию проводят на сефадексе G-25, который по способности задерживать примесные частицы, учитывая размер молекулы пероксидазы (около 40 кДа), уступает сефадексу G-100.

Сущность изобретения иллюстрируется следующим примерами.

Пример 1. Получение грубого экстракта

50 кг корней хрена отмывают под проточной водой и проращивают в течение 140-160 ч при температуре +25±1°С. Пророщеные корни измельчают на лопастном гомогенизаторе и заливают 50 л 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия (рН 4,4±0,2). Суспензию экстрагируют в течение 12±2 ч при постоянном перемешивании, затем центрифугируют.

К супернатанту-1 объемом 60 л для отделения балластных белков при непрерывном перемешивании добавляют сульфат аммония до 45-48% насыщения. (Под 100%-ным насыщением имеется в виду количество соли, при добавлении которого раствор становится насыщенным, а при дальнейшем добавлении соли раствор становится пересыщенным, и соль выпадает в осадок. Для растворов с сульфатом аммония 100% насыщением является добавление и полное растворение 70,7 г сульфата аммония в 100 мл дистиллированной воды.) Осадок-1 отделяют центрифугированием. Далее образовавшийся супернатант-2 объемом 55 л для осаждения пероксидазы насыщают сульфатом аммония до 85%, осадок-2 отделяют центрифугированием. Образовавшийся осадок-2 растворяют деионизованной водой до конечного объема 200±10 мл, нерастворившийся осадок-3 отделяют центрифугированием.

Гель-хроматография на сефадексе G-100.

Раствор пероксидазы наносят на колонку объемом 1 л, заполненную сефадексом G-100. Элюцию ведут 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия (рН 4,4-5,0) со скоростью 100 мл/ч, в ходе элюции отбирают фракции по 20 мл. В собранных фракциях измеряют R Z =D 408 /D 275 . Фракции, в которых R Z не менее 0,8, объединяют.

В сборник помещают 5 л 5±0,1 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,4-5,0) (буфер-1) и диализный мешок с объединенными фракциями пероксидазы. Диализ ведут при постоянном перемешивании в течение 24 ч, трижды меняя буфер в сборнике.

Обессоленный раствор фермента наслаивают на колонку объемом 1 л, заполненную карбоксиметилцеллюлозой и уравновешенную буфером-1. Элюцию ведут со скоростью 50 мл/ч в линейном градиенте 5 мМ-0,1 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л). В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,5, объединяют.

В сборник помещают 5 л 20±0,1 мМ калий-фосфатного буфера (рН 8,0±0,1) (буфер-2) и диализный мешок с объединенными фракциями фермента. Диализ ведут аналогично.

Концентрирующая хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.

Раствор фермента с рН 8,0±0,1 наслаивают на колонку объемом 300 мл, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию ведут буфером-2 со скоростью 50 мл/ч. Фракции, в которых значение R Z не менее 3,0, объединяют.

В сборник помещают 5 л деионизованной воды и диализный мешок с раствором пероксидазы. Диализ ведут аналогично.

Лиофильная сушка.

Раствор пероксидазы переносят в стерильную термостойкую колбу, замораживают жидким азотом и лиофильно сушат до полного высыхания препарата.

Пример 2 (сравнительный)

В данном примере выдержаны условия получения пероксидазы по прототипу, но для улучшения основных показателей пероксидазы изменены две существующие в прототипе стадии, а именно: для ультрафильтрационного концентрирования раствора пероксидазы используют два типа колонок с полыми волокнами, в отличие от прототипа, где используют один тип волокон, и дробное фракционирование белков солями сульфата аммония (как в заявляемом способе).

Получение грубого экстракта.

50 кг корней хрена отмывают под проточной водой и зачищают на 1/3 часть массы в присутствии 33,5 л 0,25% раствора пищевой аскорбиновой кислоты, в котором полученные очистки выдерживают в течение 1 ч для экстракции фермента пероксидазы. Далее экстракт центрифугируют на проточной центрифуге и выдерживают в течение 24 ч для "созревания" фермента.

Первичная очистка и концентрирование.

В полученный экстракт добавляют 1,7 кг (5% по весу) сульфита натрия и экстракт подвергают концентрированию и первичной очистке методом ультрафильтрации на установке с полыми полимерными волокнами УПВ-6, укомплектованной колонками с фильтрами, имеющими размеры пор 60 кДа и 5 кДа. Принципиальная схема установки представлена на Фиг.2, где показаны центробежный насос 1; предфильтр 2; колонка с волокнами, имеющими размер пор 60 кДа 3; колонка с волокнами, имеющими размер пор 5 кДа 4; фильтрат пероксидазы 5; концентрированный раствор пероксидазы 6; фильтрат, содержащий низкомолекулярные белки 7.

Фракционирование белков солями сульфата аммония.

К концентрату объемом 6 л для отделения балластных белков при непрерывном перемешивании добавляют сульфат аммония до 45-48% насыщения. Осадок отделяют центрифугированием. Далее образовавшийся супернатант объемом 5,7 л для осаждения пероксидазы насыщают сульфатом аммония до 85%, осадок отделяют центрифугированием, который растворяют бидистиллированной водой до конечного объема 200±10 мл, нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием.

Гель-хроматография на сефадексе G-25 и G-50.

Дальнейшую очистку пероксидазы проводят на колонке для гельфильтрации, заполненной сефадексом G-25 и уравновешенной бидистиллированной водой. Раствор пероксидазы наносят на колонку, элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, в которых R Z не менее 0,2. К собранным фракциям добавляют сульфат аммония до 90% насыщения, перемешивают до полного растворения соли и центрифугируют. Осадок растворяют в 3-кратном по объему количестве бидистиллированной воды и наносят на колонку для гельфильтрации, заполненную сефадексом G-50 и уравновешенную бидистиллированной водой. Элюирование проводят бидистиллированной водой. Собирают фракции, в которых R Z не менее 0,6. С помощью 50% уксусной кислоты значение рН во фракциях с пероксидазой устанавливают на уровне 4,4.

Хроматография на карбоксиметилцеллюлозе.

Фракции пероксидазы наслаивают на колонку объемом 1 л, заполненную карбоксиметилцеллюлозой, предварительно уравновешенную 5 мМ ацетатным буфером с рН 4,4. Элюирование проводят линейным градиентом 5 мМ-0,15 М ацетатного буфера (рН 4,4±0,2) (V=S-0,5 л, R-0,5 л) в течение 1 часа. В белковых фракциях измеряют величину R Z . Фракции, в которых значение R Z не менее 2,7, объединяют, устанавливают рН 5,0 добавлением аммиака и лиофильно высушивают.

Сравнительные данные по примеру 1 и 2 приведены в таблице.

Таким образом, как видно из примеров и таблицы, заявляемый способ получения пероксидазы из корней хрена (пример 1) позволяет получать пероксидазу с высокими выходами, с чистотой и активностью, достаточной для использования данного фермента в качестве составной части конъюгатов для иммуноферментных анализов. А в условиях прототипа (пример 2) даже при усовершенствовании двух стадий, улучшающих показатели, выход, удельная активность и чистота целевой пероксидазы ниже аналогичных показателей заявляемого способа.

Данный способ может быть использован в промышленном получении пероксидазы из корней хрена.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения фермента пероксидазы из корней хрена, включающий размельчение и гомогенизацию пророщенных корней хрена, экстракцию гомогенизата корней хрена, отделение балластных белков и осаждение пероксидазы солями сульфата аммония, гельфильтрацию раствора пероксидазы на сефадексе, хроматографическую очистку на карбоксиметилцеллюлозе, лиофильную сушку целевой пероксидазы, отличающийся тем, что измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия; гельфильтрацию раствора пероксидазы осуществляют на сефадексе G-100, проводят диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0 и диализ против калий-фосфатного буфера с рН 8,0±0,1, и концентрирование с дополнительной очисткой на ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буфером с последующим диализом против деионизованной воды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченные корни хрена экстрагируют 0,15±0,01 М раствором хлорида натрия с рН 4,4±0,2.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что дважды используют осаждение белков солями сульфата аммония: для отделения балластных белков используют 45-48% насыщение, а для осаждения пероксидазы используют 85-90% насыщение.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что гельфильтрацию проводят на сефадексе G-100 с элюированием 0,15-0,2 М раствором хлорида натрия с рН 4,4-5,0.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматографической очистке пероксидазы на карбоксиметилцеллюлозе предшествует диализ против натрий-ацетатного буфера с рН 4,4-5,0.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что лиофильной сушке предшествует диализ раствора пероксидазы против деионизованной воды.

ях между ними [Воронова и др., 1981]. Применение хрома-тографических методов исследований позволило выделить два белка с пероксидазной активностью и изучить некоторые каталитические свойства их в опыте и контроле [Андреева и др., 1979; Андреева, 1981]. Это дало возможность получить новую информацию об активности изопероксидаз вирозных растений.

Из работ, вышедших за последнее время, наибольшее внимание заслуживает коллективный труд авторов «Биохимия иммунитета, покоя, старения растений» , выполненный в Институте биохимии им. А. Н. Баха. Изучая различные стороны метаболизма растений, пораженных грибными заболеваниями, авторы дают анализ различных биотических индукторов защитных реакций растений и возможные пути их практического использования. Однако в нем не проанализированы сведения о биохимии защитных реакций растений, зараженных вирусами. Взаимодействие растений-хозяев и вирусов, их поражающих, происходит иначе, чем при заражении грибами и бактериями, так как у вирусов нет

собственной ферментной системы. Вирус индуцирует в клетках растений* процессы, полностью зависящие от метаболических путей хозяина. К тому же один и тот же вирус может вызывать различную реакцию у разньш хозяев, а разные вирусы - неидентичные реакции у одного и того же хозяина. В настоящее время мы имеем, как правило, разрозненный мате* риал, полученный на растениях-хозяевах в различные сроки заражения и взятия проб для эксперимента. Исследователи выделяют отдельные мета4 болические реакции и на их основе пытаются понять взаимодействие вирус-растение. Очевидно, совершенно необходимо проводить исследования на одном растении-хозяине, поражаемом как вирусным, так и грибным заболеванием, в целях четкого понимания общих закономерно! стей и определенных различий в путях иммунных процессов инфицирован-, ных растений.

Современная сельскохозяйственная практика (посев семенами одного сорта на больших площадях, применение фунгицидов, инсектицидов и т. д.) способствует возникновению новых рас патогенов, которые могут в сильной степени поражать ранее устойчивые сорта растений. Если в прежние годы сорта могли сохраняться 2-3 десятилетия, то теперь устойчивость к возбудителям теряется уже через 5-7 лет [Конарев, 1985]. В условиях промышленного возделывания растений из природной популяции могут выделяться и накапливаться сильновирулентные штаммы вирусов, поражающие постоянно высеваемые культуры. Все это определяет необходимость глубокого изучения биохимических основ механизмов фитоиммунитета, а полученные теоретические разработки более эффективно использовать для приемов борьбы и защиты растений от патогенов.

Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО АН СССР кандидатам химических наук Олегу Борисовичу Максимову, Раисе Петровне Горшковой и Нине Арвидовне Василевской за консультацию и помощь в выполнении работ по определению углеводов и фенольных соединений, а также Светлане Ильиничне Омельченко, принимавшей активное участие в проведении совместных исследований.

ПЕРОКСИДАЗА - ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА

Проявление пероксидазной функции у биологических объектов было замечено еще в прошлом веке, на заре изучения органических веществ. Самое раннее сообщение о пероксидазе появилось в 1855 г., после того как Шенбейн провел окисление ряда органических соединений разбавленными растворами перекиси а присутствии экстрактов из растений и животных . Название «пероксидаза» дал Линозье ферменту, выделенному им из гноя лизированных лейкоцитов и катализирующему окисление разных соединений за счет перекисного кислорода (Linossier, 1898, цит. [Михлин, 1947]). Линозье первым привел различия между «оксидазами» и «пероксидазами». Как пишет Д. М. Михлин, выделением пероксидазы в сравнительно чистом виде и изучением основных ее свойств мы обязаны Алексею Николаевичу Баху и его сотрудникам. В 1903 г. они выделили пероксидазу, относительно свободную от других ферментов (в том числе от каталазы), чем было окончательно опровергнуто долгое время господствовавшее мнение о тождественности пероксидазы и каталазы.

А. Н. Бах и Р. Шода для оценки активности растительной пероксидазы использовали окисление пирогаллола до окрашенного пурпурогаллина (Bach, Shodat, 1903, цит. по: [Роговин и др., 1977]). Они нашли, что скорость образования пурпурогаллина пропорциональна концентрации.фермента и перекиси водорода. Этим методом пользуются биохимики и поныне для оценки активности как растительных, так и животных пероксидаз. В дальнейших исследованиях были определены оптимум действия пероксидазы, температурная зависимость, оптимум концентрации водородных ионов, установлено также значение концентрации субстрата в реакциях с ферментом и т. д. Для уровня исследований тех лет это было значительным шагом вперед в области изучения белков-ферментов растений. Именно тогда А. Н. Бахом была высказана гипотеза об участии перекисей в окислении органических соединений.

С годами интерес к ферменту пероксидазе не ослабевал. В 30-50-е годы внимание многих исследователей было приковано к таким геми-новым белкам, как пероксидаза, каталаза, цитохромы и гемоглобин. Подтверждением тому служит работа Д. М. Михлина «Пероксиды и пероксидазы», вышедшая в 1947 г. В 60-70-е годы большое внимание уделялось пероксидазам больного растения на кафедре физиологии

растений МГУ членом-корреспондентом ВАСХНИЛ Б. А. РубиныЛ и его сотрудниками. В 80-е годы на кафедре химической энзимологии МГУ, возглавляемой членом-корреспондентом АН СССР И. В. Бере! зиным, успешно велось изучение каталитических свойств пероксидазы, вы! деленной из растений хрена. Согласно сводке литературы, представленное швейцарскими и канадскими исследователями, только с 1970 по 1980 г. вышло из печати 1600 научных статей , посвященных этому ферменту. В них освещены различные стороны физико-химического строения, биологического действия и участия в метаболических процессах пероксидаз, в основном растительного происхождения. Представленный авторами список работ не является полным, так как не были учтены работы, касающиеся пероксидаз микро- и макроорганизмов.

Повышенное внимание к этому ферменту прежде всего вызвано тем, что до сих пор остается невыясненным наличие большого набора изоэнзимов (от 3 до 42) у многих исследуемых растительных пероксидаз. Скандалиоз считает пероксидазы «семейством» ферментов со сходными физиолого-биохимическими свойствами, где многое еще необходимо выяснить . Другой, не менее интересный вопрос заключается в широкой субстратной специфичности или, в узком понимании этого определения, в отсутствии таковой для пероксидаз. Установлено, что пероксидазы неспецифичны в отношении доноров водорода, но строго специфичны а отношении второго субстрата - перекиси водорода при проявлении пероксидазной функции фермента. Возможное участие пероксидаз в защитных реакциях или в других проявлениях патогенеза также способствует сохранению постоянного внимания исследователей к этому ферменту.

1.2. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ МОЛЕКУЛЫ

Пероксидаза - двухкомпонентный фермент, представляющий собой сочетание активной группы, вступающей в химическое взаимодействие с субстратами, и коллоидального белкового «носителя», усиливающего каталитическое действие этой группы. Это глобулярный белок диаметром 50 A , который содержит около 43% а-спираль-ных участков в составе белковой части молекулы . По номенклатуре ферментов, принятой на Международном биохимическом съезде в 1979 г., пероксидаза - фермент, действующий на перекись водорода в качестве акцептора. Единственный подподкласс (1.11.1) составляют пероксидазы, где под кодовым номером семь стоит истинная пероксидаза - донор: Нг СЬ-оксидоредуктаза (КФ 1.11.1.7), о каталитическом действии которой более подробно будет сказано ниже.

Изученные до настоящего времени пероксидазы состоят из неокрашенного гликопротеина и соединенного с ним коричнево-красного ферри-порфирина. Геминовая часть молекулы (гем, гемин)-железопротопор-фирин IX представлен на рис. 1. Выполняя роль активного центра, он участвует в разложении или активации перекиси водорода, в результате чего возникают радикалы соответствующих субстратов . Простетическая группа пероксидаз хрена и японской редиски, цитохрома с, хлоропероксидазы известна как феррипротопорфи-рин IX. Полагают, что все известные пероксидазы и их изоформы содержат этот гем, поскольку они ингибируются азидами и цианидами.

Пероксидаза

Протогематин IX Гликопротеин

Fe3* Протопорфирин IX

Феррипротопорфирин IX входит в активный центр, составляя порфи-риновое кольцо гема, являющегося высокоароматичным и гидрофобным соединением. Именно гидрофобное взаимодействие порфиринового макроцикла с белком формирует третичную структуру нативной пероксидазы. Известно, что протопорфирин оказывает важное стабилизирующее влияние на белковую глобулу гемсодержащих ферментов. Так, комплексообра-зование апопероксидазы хрена с гемином резко повышает устойчивость белка к действию ультрафиолета и тепла. Удаление простетической

группы фермента ведет к потере пероксидазной активности, но не ска1 зывается на ее оксидазной функции .

Хилл и Холден в 1926 г. впервые добились успеха в расщеплении молекулы пероксидазы на простетическую группу и протеин, применяв обработку соляной кислотой и ацетоном . Маэли , используя различные приемы щелочного и кислотного гидролиза гем-протеиновой связи, показал, что при нейтрализации щелочью НСЫ расщепляющего раствора в присутствии подходящего буфера происхо-1 дит рекомбинация протогемина и протеина в активную пероксидазу] И эта обратимая реакция может быть повторена несколько раз с тем же энзимом без заметных потерь активности. Автор также отметил, чтя белок пероксидазы хрена устойчив при щелочном рН, а цвет ге

В клетках растений и животных непрерывно протекают сложные химические процессы. Они регулируются белковыми веществами - ферментами , которые играют роль катализаторов химических реакций в клетках. Для изучения таких биохимических процессов нужны сложные приборы и множество реактивов. Однако некоторые биохимические явления можно наблюдать, как говорится, и невооруженным глазом.

Начнем с окислительных ферментов - оксидаз и пероксидаз. Они присутствуют во многих живых тканях, потому что окисление лежит в основе процессов дыхания. Но действуют эти ферменты по-разному: оксидазы окисляют органические вещества кислородом воздуха, пероксидазы для той же цели «добывают» кислород из пероксидов. Конечно, вещества медленно окисляются и без помощи ферментов, но ферменты ускоряют реакцию во много тысяч раз.

При окислении некоторых веществ, например, фенола и гидрохинона, образуются окрашенные продукты реакции. Появление окраски говорит о том, что фермент сработал. А интенсивность окраски позволяет судить о количестве продуктов окисления. Если же окраска вообще не появляется, значит, фермент неактивен. Это может случиться в слишком кислой или слишком щелочной среде, или если отсутствуют поставщики кислорода, или в присутствии вредных для ферментов веществ - так называемых ингибиторов ферментов .

После этого небольшого вступления - сами опыты. Вам понадобятся: капустная кочерыжка, яблоко, клубень картофеля с ростками, луковица с корешками, проросшая в темноте. Реактивами будут служить холодная кипяченая, а еще лучше дистиллированная вода, гидрохинон (из магазина фототоваров) и аптечная перекись водорода. Запаситесь также теркой для овощей, водяной баней, пробирками или флакончиками из-под пенициллина, чистыми пипетками и марлей либо белой тканью.

Начнем исследования с капустного сока. Кусочек капустной кочерыжки, примерно 20 г, измельчите на терке, полученную кашицу отожмите через два слоя марли или один слой ткани, сок соберите в стакан и разбавьте водой в десять раз. Сразу же предупреждаем: при исследовании других растительных объектов сок нужно разбавлять не более чем в два-три раза.

Шесть чистых сухих пробирок или флакончиков пронумеруйте. В пробирки № 1, 2, 3 и 4 налейте по 1 мл разбавленного капустного сока. Пробирки 1 и 2 поставьте для разрушения (инактивации) ферментов минут на пять в кипящую водяную баню, а затем охладите до комнатной температуры. В пробирки 5 и 6 вместо сока налейте по 1 мл воды.

Во все шесть пробирок добавьте немного, на кончике ножа, гидрохинона. Затем в пробирки 1, 3 и 5 налейте по пять капель воды, а в пробирки 2, 4 и 6 - по пять капель пероксида водорода. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешайте.

Через 10-15 минут можно уже наблюдать результаты опыта. Настоятельно советуем записать их в виде таблицы. Внесите в таблицу номера пробирок и состав смеси в каждой из них, в графе против каждой смеси пометьте, изменилась ли окраска в ходе опыта, а если изменилась, то как именно. В следующей графе сделайте вывод - произошло ли окисление.

Когда вся таблица будет заполнена, попытайтесь проанализировать полученные результаты. Для этого подумайте над такими вопросами.

Может ли пероксид водорода окислить гидрохинон в отсутствие капустного сока?

Окисляется ли гидрохинон под действием сока капусты без пероксида водорода?

Сохраняется ли активность ферментов в соке после кипячения?

Какие окислительные ферменты содержатся в капустном соке - оксидазы или пероксидазы?

Однако на основании опыта с растениями одного вида рано еще делать окончательные выводы. Поэтому поставьте такие же опыты с клубнем картофеля и его ростками, с мякотью яблок, с мясистыми чешуями луковицы, а также с ее донцем и листьями («перьями»). Напоминаем: в этих случаях полученный сок надо разбавлять водой в 2-3 раза.

Когда все опыты проделаны, можно определить, в каком из исследованных материалов окислительные ферменты активнее. Как вы считаете, могут ли одновременно присутствовать в растительных тканях оксидазы и пероксидазы?

Попытайтесь сделать выводы сами, не заглядывая в объяснение. А когда выводы сделаны, проверьте, насколько они правильны.

Вывод первый. Пероксид водорода может постепенно окислять гидрохинон и без сока: в пробирках 5 и 6 медленно появляется розовая окраска. Значит, фермент необязателен для реакции. Как и все катализаторы, ферменты лишь ускоряют начавшуюся реакцию во много раз. Вы заметили, конечно, как быстро появилась окраска в пробирке 4. Однако пероксидазы не могут ускорить реакцию гидрохинона с кислородом воздуха (окраска в пробирке 3 отсутствует или появляется очень медленно).

Вывод второй. Фермент можно вывести из строя даже кратковременным кипячением. В пробирке 2 окраски практически нет. Ведь ферменты - это белки; они свертываются при нагревании - в пробирках 1 и 2 появились белковые хлопья.

Вывод третий. В пробирке 3 окраска не появилась. Значит, в капустном соке содержатся только пероксидазы, ускоряющие окисление гидрохинона лишь в присутствии пероксида водорода. Однако в опытах с картофельными клубнями и яблоком окраска появляется, и особенно быстро при встряхивании флакона, когда раствор обогащается кислородом воздуха. Значит, в картофеле и яблоке есть оксидазы (конкретнее-фенолоксидаза), способствующие окислению гидрохинона кислородом. Поэтому и темнеют на воздухе разрезанные клубни картофеля и яблоки - они содержат вещества, родственные гидрохинону. Оксидаза также теряет активность при нагревании. Вспомните, темнеет ли вареный картофель?

Наконец, четвертый вывод . В картофеле и яблоке есть также оксидазы - при добавлении пероксида в пробирку 4 окраска появляется скорее. А в мясистых чешуях лука оксидазы нет. Они не темнеют на воздухе даже с гидрохиноном.

Кстати, вы обратили внимание на то, что окислительные ферменты особенно активны в готовящихся к росту или растущих органах растений - в донце луковицы и ее корешках, в ростках клубней картофеля? Обмен веществ идет там наиболее интенсивно.

Итак, мы выяснили, что не всякие условия среды благоприятны для действия ферментов. Если сильный нагрев инактивирует ферменты, то, может быть, они более активны при низкой температуре? Проверим и это. Для опыта нужны будут дополнительно четыре стеклянные или металлические банки емкостью около одного литра и лед или снег (примерно 1 кг). Опыт поставим с капустной кочерыжкой.

Натрите кочерыжку на терке, сок, как и прежде, отожмите через марлю или ткань и разбавьте водой в двадцать раз. Пронумеруйте вновь пробирки, если старая нумерация почему-либо стерлась, и налейте в пробирки 1, 2, 3 и 4 по 1 мл разбавленного капустного сока, а затем добавьте гидрохинон на кончике ножа. В пробирки 5 и 6 вместо сока налейте по 1 мл воды и тоже насыпьте гидрохинон. А затем расставьте пробирки следующим образом: 1 - в банку со снегом или льдом; 2 - в банку с теплой водой (40°С); 3 - в банку с горячей водой (60°С); 4 - оставьте на столе при комнатной температуре; 5 - в банку с кипящей водой; 6 - оставьте при комнатной температуре.

Через 5 мин после начала опыта во все пробирки, начиная с более холодных, влейте по пять капель пероксида водорода. Смесь осторожно взболтайте и заметьте время начала реакции. Еще через 5 мин выньте пробирки из банок и запишите результаты опыта в виде таблицы, примерно такой же, как и в прошлый раз. Когда таблица заполнена, можно заняться анализом полученных данных.

Попробуйте сделать выводы самостоятельно, ответив сначала на следующие вопросы.

Ускоряется ли реакция окисления при повышении температуры без добавления фермента?

Можно ли сказать, что ферменты лучше действуют при охлаждении?

Какая температура наиболее благоприятна для действия пероксидаз?

Почему пищевые продукты дольше сохраняются в холодильнике?

Для чего кипятят молоко?

Почему теплокровные животные - млекопитающие и птицы - наиболее развитые и жизнеспособные животные на Земле?

Вы ответили на все эти вопросы? Тогда - наши пояснения.

Вы, вероятно, заметили, что скорость окисления гидрохинона пероксидом водорода неодинакова при низкой и высокой температурах. При высокой температуре скорость окисления, естественно, выше. Пероксидазы облегчают взаимодействие гидрохинона с пероксидом. В присутствии фермента реакция проходит даже при низкой температуре, однако чем выше температура, тем легче ферменту активировать молекулы реагирующих веществ.

Но нельзя забывать, что белки при высокой температуре свертываются, скорость реакции снижается. Существует понятие оптимальной температуры действия ферментов, при которой они проявляют наибольшую активность. Для разных ферментов эта температура неодинакова, но многие ферменты, в том числе и пероксидазы, имеют температурный оптимум 40-50°С.

Пищевые продукты портятся под действием ферментов, которые содержатся в них или выделяются микроорганизмами. На холоде активность ферментов снижается - вот почему в холодильнике продукты портятся меньше.

На верхнюю ступень эволюции поднялись теплокровные животные, которые могут поддерживать температуру тела, оптимальную для деятельности ферментов.

О. Ольгин. "Опыты без взрывов"
М., "Химия", 1986

ПЕРОКСИДАЗЫ - группа окислительно-восстановительных ферментов (КФ 1.11.1.1 - 1.11.1.10), использующих в качестве акцептора электронов перекись водорода (H 2 O 2); катализируют реакцию:

Биол, значение П. определяется их участием в окислении различных субстратов на мембранах митохондрий и микросом. Основными биол, субстратами растительных П. являются полифенолы (см.). Катализируя окисление полифенолов при участии H 2 O 2 , П. принимают участие в процессе дыхания растительной клетки. У животных и человека П. также принимают участие в ряде окислительных процессов, протекающих в тканях. Так, П. в присутствии H 2 O 2 катализируют окисление адреналина, гистамина, жирных к-т, нуклеотидов, йодида. Образующийся в результате перокси-дазного окисления йодид-иона йод используется в процессе синтеза гормона щитовидной железы - тироксина. П. щитовидной железы, кроме окисления йодида, катализирует также ковалентное связывание дийодотирозиновых остатков, приводящее к образованию тироксина. Лакто-пероксидаза и П. лейкоцитов катализируют перекисное окисление липидов в присутствии H 2 O 2 и 1~. Предполагают, что такие системы придают антимикробную активность молоку, слюне и полиморфно-ядерным лейкоцитам. Степень активности П. в лейкоцитах служит дополнительным тестом при диагностике острого миелобластного лейкоза. П. слюны играют определенную роль в патогенезе пародонтоза. Определение активности П. в слюне используют в качестве вспомогательного теста при диагностике пародонтоза и для контроля эффективности его терапии.

В тканях животных содержится активная глутатионпероксидаза. В печени с действием этого фермента связано разрушение H 2 O 2 , которая образуется в результате деятельности различных оксидаз. Реакция, катализируемая глутатионпероксидазой, связана с окислением глюкозо-6-фосфата и одновременным восстановлением окисленного глутатиона, образующегося при восстановлении H 2 O 2 в пероксидазной реакции. Описано окисление восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов системой O 2 -Mn 2+ -Пероксидаза.

П. используют для клинико-биохимического анализа в качестве одного из компонентов реакционной смеси при определении содержания глюкозы в биол, жидкостях глюко-зооксидазным методом (см. Городецкого методы).

Пероксидазная реакция была открыта в 1855 г. Шенбейном (Ch. F. Schonbein), а название этой группы ферментов «пероксидазы» предложил в 1898 г. Линоссье (М. Linossier).

П. широко распространены в животном и растительном мире. В больших количествах они содержатся в корнях хрена и турнепса, в млечном соке фигового дерева. У животных П. присутствуют в молоке, печени, слизистой оболочке кишок, слюнных железах, лейкоцитах, эритроцитах.

Физ.-хим. и биол, свойства П. наиболее детально изучены на примере пероксидазы из корней хрена, которая в 1941 г. была получена X. Теореллем в кристаллическом виде.

П. представляют собой гемопротеиды с мол. весом (массой) от 40 000 до 100 000. Была показана возможность обратимого отделения апофермента от простетической группы, которая является протогематином. Добавление чистого протогематина к апоферменту П. вызывало почти полное восстановление активности фермента. Установлено, что в процессе пероксидазной реакции окисляемый субстрат присоединяется непосредственно к атому железа простетической группы фермента. Пероксидазной активностью (хотя и относительно слабой) обладает и гемоглобин; это его свойство используют для экспресс-определения присутствия крови или гемоглобина, напр, в моче, а также идентификации следов крови в суд.-мед. практике.

Р-ры чистой П. имеют характерные максимумы поглощения в видимой области спектра при 645, 583, 548 и 498 нм.

П. проявляют высокую специфичность к перекисной группировке и во многих случаях мало специфичны по отношению к донору водорода (за исключением бактериальных П. и пероксидазы из земляного ореха). В отсутствие донора водорода (окисляемого субстрата) П. образуют комплексы с H 2 O 2 , что сопровождается изменением спектра поглощения фермента. П. образуют с H 2 O 2 четыре типа комплексов, легко обнаруживаемых спектрофотометрически (см. Спектрофотометрия). Комплекс I образуется сразу же при добавлении H 2 O 2 к ферменту и представляет собой нестойкое соединение зеленого цвета, к-рое обычно быстро превращается в комплекс II светло-красного цвета. При избытке H 2 O 2 образуются комплексы III и IV - соединения темно-красного цвета. Эти комплексы каталитически неактивны, их образование приводит к генактивации фермента.

П. относительно термостабильны. В низких концентрациях их ингибируют так наз. дыхательные яды (цианид, азид, сульфид), связывающие железо в геминовых группах П., а также гидроксиламин, тиомочевина, окись азота.

Активность П. можно определять по количеству пирогаллола (см.), окисленного H 2 O 2 в присутствии фермента. Продукт окисления пирогаллола пурпурогаллин экстрагируют после осаждения белка из инкубационной смеси эфиром и определяют фотометрически. Об активности П. судят по рассчитанному количеству пурпурогаллина (пур-нурогаллиновое число), образуемого при действии 1 мг сухого ферментного препарата в течение 5 мин. при 20° из 5 г пирогаллола, растворенного в 2 л воды, содержащей 10 мл 0,5% р-ра H 2 O 2 .

Библиография: Барабаш Р. Д. и др. Роль пероксидазы в патогенезе пародонтоза, Вопр. мед. хим., т. 25, № 3, с. 333, 1979; Диксон М. и У э б б Э. Ферменты, пер. с англ., с. 96 и др., М., 1966; Номенклатура ферментов, пер. с англ., под ред. А. Е. Браунштейна, с. 75, М., 1979.

И. В. Веревкина.