Поглощением или абсорбцией называется явление потери энергии световой волны, проходящей через вещество, вследствие преобразования световой энергии волны в разные формы внутренней энергии вещества или в энергии вторичного излучения другого направлений и спектрального состава. При прохождении света через вещество происходит поглощение энергии, вследствие чего интенсивность света уменьшается. Изменение интенсивности света выражается экспериментальным законом, которая называется законом Бугера.
Где I 0 - интенсивность света падающего на вещество
I - интенсивность с вышедшего из вещества
х - толщина вещества
α- коэффициент поглощения, зависящей от длины волны падающего света, химического состава вещества и его агрегатного состояния.
Коэффициент поглощения . Если α численно равен обратной величине от толщины вещества, то есть , то интенсивность вышедшего света уменьшается в е раз. Рассмотрим, как зависит коэффициент поглощения от длины волны и структуры вещества.
Одноатомные газы
В природе (в космосе) очень часто встречается вещество, которую можно представить как разряженный одноатомный газ. Атомы химических элементов также можно представить как одноатомный газ. Из-за того, что атомы находится на больших расстояниях друг от друга, свет через такие вещества проходит, практически не поглощаясь. Поглощение света наблюдается лишь в том случае, когда частота падающего света совпадает с собственной частотой внешнего оптического электрона. ν =ν 0 !
В этом случае, электрон поглощает энергию падающего света всю порцию hν. Наблюдается поглощение в очень узкой области и образуется линейчатый спектр поглощения.
α=10 -11 -10 -12 м -1
Молекулярные газы
Если вещество находится в молекулярном состоянии, то есть в состав молекулы входят несколько атомов, то поглощение света будет наблюдаться, когда частота падающего излучения соответствует частоте колебании атомов в молекулах и электронов в атомах.
Если вещество находится в молекулярном состоянии, то наблюдается поглощение в некотором интервале ∆ν, в результате чего спектр получается полосатым.
α=10 -8 -10 -10 м -1
Диэлектрики
Для прозрачных диэлектриков поглощение невелико α=10 -5 -10 -7 м -1 , но для них наблюдается селективное поглощение (выборочное). Такое поглощение связано с тем, что в диэлектриках нет свободных электронов, и поглощение вызвано явлением резонанса при вынужденных колебаниях электронов в атомах и молекулах, имеющих достаточно прочную связь друг с другом. Диэлектрики дают сплошной спектр поглощения.
Поглощение в металлах
Металлы полностью поглощают свет и α=10 3 -10 4 м -1 , то есть металлы непрозрачны для света. Такое сильное поглощение связано с тем, что в металлах есть свободные электроны, и при попадании света в металлах возникают быстропеременные электрические токи . Эти токи быстро затухают, превращаясь в джоулевую теплоту. Чем больше проводимость металла, тем сильнее он поглощает световую волну. Там, где происходит поглощение, наблюдается аномальная дисперсия. На графике представлена зависимость показателя преломления от длины волны и коэффициент поглощения α от длины волны. Зависимость α от λ представлена для линейчатого спектра. В реальности линейчатый спектр не бесконечно тонкая линия, а некоторая кривая имеющая острый максимум. На графике видно, что поглощение происходит между точкой АВ, где наблюдается аномальная дисперсия.
Зависимостью α от λ объясняется окрашенность поглощающих тел. Например, если стекло слабо поглощает красные лучи, но сильно поглощает синие цвета, то при падении белого света на такое стекло, оно будет выглядеть красным. Мы видим за счет отраженного света. Если же такое стекло осветить зеленым или синим светом, то оно нам будет казаться черным, так как сильно поглощает.
Такие явления используются в светофильтрах. В них в зависимости от химического состава вещества пропускается свет, только определение длины волны, а все остальные длины волн поглощаются. Разнообразие пределов селективного поглощения и разных веществ объясняет многообразие цветов в природе. Насчитывается до миллионов разных цветов и оттенков. В физике широко используется метод абсорбционного спектрального анализа
.
При помощи этого метода изучается химическое строение разных видов. Для анализа анализируются определенные частоты, в которых наблюдается поглощение и интенсивность поглощения. Структура спектров поглощения полностью определяется составом и строением молекул, поэтому изучение спектров поглощения является основным методом количественного и качественного анализа разных веществ.
- Излучение Вавилова- Черенкова
Советские ученые Вавилов и Черенков обнаружили необычное сечение, которое вызывается в веществе при движении в нем быстро движущихся заряженных частиц. Особенность излучения заключается в следующем. Обычно заряженная частица испускают излучение, если они движутся с ускорением, если же частица движется равномерно и прямолинейно, то она не должна испускать электромагнитные излучения. Советские ученые Черенков, Тамм, Франк смогли объяснить данное излучение (Нобелевская премия 1958г.), как нелюминесцентное свечение, вызванное движением электрона со скорость большей фазовой скорости света в среде.
Если , то электрон испускает электромагнитные излучения. На эффекте Вавилова- Черенкова основана работа черенковских счетчиков, при помощи которых регистрируют быстро движущиеся заряженные частицы. Использование такого счетчика позволило Сегре (итальянский ученый) открыть антипротон (Нобелевская премия 1959г.). Особенностью данного излучения является также тот факт, что оно наблюдается не во всем пространстве, а только под острым углом θ к направлению движения электрона. Если рассмотрим это явление в пространстве, то излучение будет наблюдаться в пределах некоторого телесного угла dΩ или в пространственном конусе с образующей направление под углом θ к скорости электрона.
Но так как в точке Р наблюдается свечение, то это значит, что волны приходят туда одновременно, то есть ∆t / =0. Тогда
А так как cosθ не может быть больше единицы, V е больше скорости света в среде, то есть больше . Таким образом, действительно эффект Вавилова-Черенкова вызван движением заряженной частицы движущейся с постоянной скоростью больше .
Поглощение света
уменьшение интенсивности оптического излучения (См. Оптическое излучение)
(света), проходящего через материальную среду, за счёт процессов его взаимодействия со средой. Световая энергия при П. с. переходит в различные формы внутренней энергии среды; она может быть полностью или частично переизлучена средой на частотах, отличных от частоты поглощённого излучения. Основной закон, описывающий П. с., - закон Бугера I света, прошедшего слой среды толщиной l
, и исходного светового потока I 0 .
Не зависящий от I, I 0
и l
коэффициент k
λ называется поглощения показателем (См. Поглощения показатель) (ПП, в спектроскопии - поглощения коэффициентом); как правило, он различен для разных длин света λ.
Этот закон установил на опыте в 1729 П. Бугер . В 1760 И. Ламберт вывел его теоретически из очень простых предположений, сводящихся к тому, что при прохождении слоя вещества интенсивность светового потока уменьшается на долю, которая зависит только от ПП и толщины слоя, т. е. dl/l= -k
λ dl
(дифференциальная, равносильная первой, запись закона Бугера). Физический смысл закона состоит в том, что ПП не зависит от I
и l
(это было проверено С. И. Вавилов ым экспериментально с изменением I Поглощение света
в 10 20 раз). Зависимость k λ
от λ называется спектром поглощения вещества. Для изолированных атомов (например, в разреженных газах) он имеет вид набора узких линий, т.
е. k λ
отличен от 0 лишь в определённых узких диапазонах длин волн (шириной в десятые - сотые доли Å). Эти диапазоны соответствуют частотам собственных колебаний электронов внутри атомов, «резонирующих» с проходящим излучением и поэтому поглощающих из него энергию (рис. 1
). Спектры П. с. отдельных молекул также соответствуют собственным частотам, но гораздо более медленных колебаний внутри молекул самих атомов, которые значительно тяжелее электронов. Молекулярные спектры П. с. занимают существенно более широкие области длин волн, т. н. полосы поглощения, шириной от единиц до тысяч Å. Наконец, П. с. жидкостями и твёрдыми телами обычно характеризуется очень широкими областями (тысячи и десятки тысяч Å) с большими значениями k
λ и плавным ходом его изменения (рис. 2
). Качественно это можно объяснить тем, что в конденсированных средах сильное взаимодействие между частицами приводит к быстрой передаче всему коллективу частиц энергии, отданной светом одной из них. Другими словами, со световой волной «резонируют» не только отдельные частицы, но и многочисленные связи между ними. Об этом свидетельствует, например, изменение П. с. молекулярными газами с ростом давления - чем выше давление (чем сильнее взаимодействие частиц), тем «расплывчатее» полосы поглощения, которые при высоких давлениях становятся сходными со спектрами П. с. жидкостями. Ещё Бугер высказал убеждение, что для П. с. важны «не толщины, а массы вещества, содержащиеся в этих толщинах». Позднее немецкий учёный А. Бер (1852) экспериментально подтвердил это, показав, что при П. с. молекулами газа или вещества, растворённого в практически непоглощающем растворителе, ПП пропорционален числу поглощающих молекул на единицу объёма (и, следовательно, на единицу длины пути световой волны), т. е. концентрации с: k λ
= χ λ с
(правило Бера). Так закон П. с. приобрёл вид Бугера - Ламберта - Бера закон а; где χ λ не зависит от концентрации и характеризует молекулу поглощающего вещества. Физический смысл правила Бера состоит в утверждении независимости П. с. молекулами от их взаимодействия с окружением, и в реальных газах (даже при невысоких давлениях) и растворах наблюдаются многочисленные отступления от него.
Сказанное выше относится к средам сравнительно малой оптической толщины (См. Оптическая толщина),
равной (в пренебрежении рассеянием света) k λ l.
При возрастании k
λ l
П. с. средой усиливается на всех частотах - линии и полосы поглощения расширяются. (Объяснение этому даёт квантовая теория П. с., учитывающая, в частности, многократное рассеяние Фотон ов
в оптически «толстой» среде с изменением их частоты и, в конечном счёте, поглощением их частицами среды.) При достаточно больших k
λ l
среда поглощает всё проникающее в неё излучение как Абсолютно чёрное тело .
В проводящих средах (металлах (См. Металлы), плазме (См. Плазма) и т.д.) световая энергия передаётся не только связанным электронам, но и (часто преимущественно) свободным электронам, k
λ
в таких средах сильно зависит от их электропроводности (См. Электропроводность) а.
Значительное П. с. в проводящих средах очень сильно влияет на все процессы распространения света в них; это формально учитывается тем, что член, содержащий k
λ
входит в выражение для комплексного преломления показателя (См. Преломления показатель) среды. В несколько идеализированном случае П. с. только свободными электронами (электронами проводимости) nk λ =
4πσ/c
(n -
действительная часть показателя преломления, с -
Скорость света). Измерения П. с. металлами позволяют определить многие характерные их свойства; опытные данные при этом хорошо описываются современной квантовой теорией металлооптики (См. Металлооптика).
В теоретических расчётах часто пользуются величиной χ,
связанной с k λ
соотношением nχ) равно 1, то в слое среды толщиной λ интенсивность света уменьшается в е
4π ,
т. е. Поглощение света в 100 000 раз. Т. к. очень сильное П. с. характерно для металлов (по крайней мере в видимой и инфракрасной областях спектра), то, по предложению М. Планк а,
П. с. средами с (n
χ) ≥ 1 называется «металлическим». В терминах квантовой теории при П. с. электроны в поглощающих атомах, ионах, молекулах или твёрдых телах переходят с более низких уровней энергии (См. Уровни энергии) на более высокие (см. также Квантовые переходы). Обратный переход в основное состояние или в «нижнее» возбуждённое состояние может совершаться с излучением фотона или безызлучательно. В последнем случае энергия возбуждённой частицы может, например, в столкновении с др. частицей перейти в кинетическую энергию сталкивающихся частиц (см. Столкновения атомные). Тип «обратного» перехода определяет, в какую форму энергии среды превращается энергия поглощённого света. В световых потоках чрезвычайно большой интенсивности П. с. многими средами перестаёт подчиняться закону Бугера - k λ
начинает зависеть от I.
Связь между I
и I 0
становится нелинейной (нелинейное П. с.). Этот эффект, в частности, может быть обусловлен тем, что очень большая доля поглощающих частиц, перейдя в возбуждённое состояние и оставаясь в нём сравнительно долго, меняет (или совсем теряет) способность поглощать свет, что, разумеется, заметно изменяет характер П. с. средой. (Опыты Вавилова, показавшие соблюдение закона Бугера и при больших интенсивностях, выполнялись с веществами, молекулы которых возбуждаются очень ненадолго - на время Поглощение света 10 -8 сек -
и в которых поэтому доля возбуждённых молекул всегда невелика.) Особый интерес представляет ситуация, когда в поглощающей среде искусственно создана Инверсия населённостей энергетических уровней, при которой число возбуждённых состояний на верхнем уровне больше, чем на нижнем. В этом случае каждый фотон из падающего потока вызывает испускание ещё одного точно такого же фотона с большей вероятностью, чем поглощается сам (см. Излучение ,
в разделе Квантовая теория излучения). В результате интенсивность выходящего потока I
превосходит интенсивность падающего I 0 ,
т. е. имеет место усиление света. Формально это явление соответствует отрицательности k λ
в законе Бугера и поэтому носит название отрицательного П. с. На отрицательном П. с. основано действие оптических квантовых усилителей (См. Квантовый усилитель) и оптических квантовых генераторов (лазеров) (См. Квантовый генератор). Лит.:
Ландсберг Г. С., Оптика, 4 изд., М., 1957 (Общий курс физики, т. 3); Борн М., Вольф Э., Основы оптики, пер. с англ., 2 изд., М., 1973; Ельяшевич М. А., Атомная и молекулярная спектроскопия, М., 1962; Гайтлер В., Квантовая теория излучения, пер. с англ., М., 1956; Соколов А. В., Оптические свойства металлов, М., 1961; Мосс Т., Оптические свойства полупроводников, пер. с англ., М., 1961. А. П. Гагарин.
Большая советская энциклопедия. - М.: Советская энциклопедия . 1969-1978 .
Смотреть что такое "Поглощение света" в других словарях:
Уменьшение интенсивности оптического излучения (света), проходящего через среду, заполненную в вом. Осн. законом, описывающим поглощение, явл. з а к о н Б у г е р а J=J0 ехр(кll), связывающий интенсивность I пучка света, прошедшего слой… … Физическая энциклопедия
Уменьшение интенсивности света, проходящего через среду, вследствие взаимодействия его с частицами среды. Сопровождается нагреванием вещества, ионизацией или возбуждением атомов или молекул, фотохимическими процессами и т. д. Поглощенная… … Большой Энциклопедический словарь
ПОГЛОЩЕНИЕ СВЕТА, уменьшение интенсивности света, проходящего через среду, вследствие взаимодействия его с частицами среды. Сопровождается нагреванием вещества, возбуждением или ионизацией атомов или молекул, фотохимическими процессами и т.д.… … Современная энциклопедия
Осуществляется верхними биогоризонтами биоценозов; свет, прошедший через толщу листьев, теряет свою интенсивность, при этом в разных частях спектра по разному. Так, в сомкнутом дубовом лесу к поверхности почвы красных лучей (0,730 мкм) приходит… … Экологический словарь
поглощение света - Превращение энергии светового излучения в другую форму энергии в результате взаимодействия её с веществом [Терминологический словарь по строительству на 12 языках (ВНИИИС Госстроя СССР)] Тематики науки технические другие EN luminous absorption DE … Справочник технического переводчика
Уменьшение интенсивности света, проходящего через среду, вследствие взаимодействия его с частицами среды. Сопровождается нагреванием вещества, ионизацией или возбуждением атомов или молекул, фотохимическими процессами и т. д. Поглощённая… … Энциклопедический словарь
поглощение света - šviesos sugertis statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Šviesos, sklindančios medžiagoje, energijos sumažėjimas dėl jos virtimo vidine medžiagos energija arba antrinio spinduliavimo energija, turinčia kitokią spektrinę sudėtį … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas
Согласно основному закону фотохимии, который является следствием закона сохранения энергии, фотохимическое действие может оказывать только тот свет, который поглощается данной системой. Тот свет, который не поглощается данной системой, фотохимических реакций вызывать не будет. Поэтому для рассмотрения энергетики фотобиологического процесса необходимо знать поглощательную способность системы. В этом отношении наиболее существенны два фактора:
- общее количество поглощаемой энергии или число квантов, поглощаемых в единицу времени (первый фактор). Этот показатель обычно оценивается с помощью оптической плотности объекта;
- величина поглощаемого кванта (второй фактор)
Первый фактор определяет возможное число реакций, совершающихся в единицу времени, т. е. скорость процесса. Второй фактор определяет энергетику самой фотореакции, т. е. определяет, какая реакция возможна.
Поток световых квантов, проходя через систему, содержащую молекулы вещества, ослабляется. Ослабление потока квантов происходит вследствие того, что часть квантов поглощается (захватывается) молекулами.
Пусть I - интенсивность светового потока, т. е. количество квантов, проходящих через данный образец в единицу времени. Ослабление интенсивности света dI будет зависеть от количества столкновений квантов с молекулами вещества. Очевидно, что число этих столкновений пропорционально числу молекул на пути светового потока, т. е. пропорционально концентрации С вещества. С другой стороны, оно должно быть также пропорционально количеству самих квантов, проходящих через систему в единицу времени, т. е. интенсивности светового потока I. Если взять достаточно малое расстояние dl, на котором происходит поглощение, то ослабление интенсивности потока dI будет пропорционально этому расстоянию. Установленные зависимости можно выразить уравнением: DI = k · I · C · dl, (3) где k - коэффициент пропорциональности; знак "минус" перед dI показывает, что световой поток уменьшается. Уравнение (3) представляет собой линейное дифференциальное уравнение первого порядка. Запишем его в следующем виде: DI / I = k · C · dl Проинтегрировав левую и правую части, получим: LnI = k · C · l=B, где l - толщина образца (длина оптического пути); В - константа интегрирования, которую необходимо определить. Пусть l = 0, тогда В = -lnI о,
lnI о - lnI = k ·
C ·
l, или
I = I о e - kCl , (5) где е - основание натуральных логарифмов. Уравнения (4) и (5) являются выражением закона Ламберта-Бера: интенсивность светового потока, проходящего через вещество, экспоненциально уменьшается в зависимости от длины оптического пути и концентрации вещества в образце . В уравнении (4) заменим натуральный логарифм на десятичный и новый коэффициент пропорциональности обозначим ε. Тогда lg I o / I = ε · C · l (6) Десятичный логарифм отношения интенсивности падающего света к интенсивности выходящего из образца, света называется оптической плотностью. Обозначив ее через D, получим: lg I o / I = D = ε · C · l (7) В этом случае закон Ламберта - Бера можно сформулировать следующим образом: оптическая плотность образца прямо пропорциональна концентрации вещества в образце и длине светового пути . В уравнении (7) ε называется молярным коэффициентом поглощения. Если l=1 и С=1, то ε=D, т. е. - это оптическая плотность образца толщиной в одну единицу (1 см) при концентрации вещества 1 моль/л. Оптическая плотность показывает поглощательную способность вещества. Поглощение тем больше, чем больше отношение I o / I, т. е. чем больше оптическая плотность. |
Вещество неодинаково поглощает свет различной длины волны. Кривая зависимости оптической плотности вещества от длины волны поглощаемого света называется спектром поглощения.
Обычно спектры поглощения молекул имеют непрерывный характер, но обнаруживают максимумы на той длине волны света, где имеется максимальное поглощение квантов света. На рис.1. приведены спектры поглощения некоторых биологически важных соединений, поглощающих свет в видимой и ультрафиолетовой областях солнечного спектра. Белки имеют максимум поглощения на длине волны 280 нм, нуклеиновые кислоты - в области 260 нм, родопсин - 500 нм, хлорофилл а имеет два максимума поглощения: 430 и 680 нм.
Как видно из рисунка, спектры поглощения имеют иногда довольно сложный вид, характерный для данного вещества и зависящий от структуры и свойств молекул данного вещества.
Изучение спектров поглощения какого-либо фотобиологического процесса позволяет выяснить, какое вещество ответственно в данном процессе за поглощение света. Это достигается в результате сравнения спектров исследуемого процесса и спектров известных веществ. Кроме этого, по положению максимумов на шкале длин волн можно определить длину волны света, преимущественно поглощаемого этим веществом.
Знание длины волны поглощаемого света позволяет определить энергию поглощаемых квантов. А по величине энергии поглощаемых квантов можно рассчитывать расположение электронных и колебательных энергетических уровней молекулы, а также переходы молекул из одного энергетического состояния в другое.
Кроме всей этой информации, величина оптической плотности дает сведения о концентрации вещества в исследуемой пробе. По величине максимумов поглощения на основании уравнения (7) можно делать заключения о концентрации вещества в исследуемом объекте.
Метод исследования фотобиологических процессов с помощью спектров поглощения называется абсорбционной спектрофотометрией. Спектры поглощения получают с помощью специальных приборов - спектрофотометров. На рис. 2 изображена схема строения спектрофотометра.
Свет от источника света Л попадает в монохроматор М , который дает излучение строго определенной длины волны. Из монохроматора свет попадает в кювету К с раствором исследуемого вещества.
Из кюветы ослабленный поток квантов направляется в ФЭУ - фотоэлектронный умножитель, который преобразовывает энергию квантов в электрическую энергию и усиливает ее. В некоторых случаях вместо ФЭУ может быть использован обыкновенный фотоэлемент с усилителем.
От ФЭУ электрический ток поступает на регистрирующее устройство Г , прокалиброванное в единицах оптической плотности. Им может быть гальванометр или самописец.
Поворачивая ручку монохроматора, на объект посылают свет различной длины волны и с регистрирующего устройства снимают показания.
В современных спектрофотометрах спектр монохроматора развертывается автоматически и также автоматически записываются показания на движущейся ленте самописца. В этом случае кювету с раствором ставят в камеру, включают прибор и получают готовую кривую - спектр поглощения.
| Страница 2 | всего страниц: 6 |
Поглощение света – это уменьшение интенсивности оптического излучения (света), проходящего через среду, заполненную веществом.
Как уже было отмечено ранее, в идеализированной однородной среде колеблющиеся электроны возвращают всю падающую энергию в виде вторичных волн, и поглощения света не происходит. В реальном теле часть падающей световой энергии переходит в другие формы (главным образом, в тепловую ) – наблюдается поглощение света .
Особый интерес представляет случай, когда частота световой волны ω совпадает с частотой собственных колебаний электронов ω о i . При этих частотах энергия световой волны полностью поглощается веществом. Такое явление называется резонансным поглощением света, а соответствующая частота – резонансной . Именно в области резонансного поглощения наблюдается аномальное поведение дисперсии. Вещество, состоящее из атомов или молекул с определенным набором частот собственных колебаний электронов ω о i даст в спектре прошедшего через него света узкие линии поглощения . Коэффициент преломления окажется постоянным в областях, далеких от линий поглощения, и будет быстро меняться с частотой и сильно отличаться от единицы вблизи каждой линии поглощения, где взаимодействие света с веществом велико.
Экспериментальная зависимость показателя преломления n ω о ) представлена на рис. 6-1.
|
|||
Рис. 6-1. Зависимость показателя преломления n и коэффициента поглощенияот длины волны вблизи одной из резонансных частот (λ о – длина волны, соответствующая резонансной частоте ω о ).
Из экспериментальной зависимости (рис.6-1) следует, что коэффициент преломления n принимает большие значения с длинноволновой стороны полосы поглощения и малые – с ее коротковолновой стороны. Внутри самой полосы поглощения коэффициент преломления убывает с уменьшением длины волны (аномальная дисперсия). Как видно, коэффициент преломления может быть меньше единицы, значит, фазовая скорость волны может превышать скорость света с . Это не противоречит теории относительности, так как скорость передачи энергии равна групповой скорости, которая не превышает значение с (смотри: 1- Приложение; 2- И.В.Савельев. Курс общей физики. Том 2. Электричество и магнетизм. Волны. Оптика. 2006 г., с. 461).
Рассмотренные выше соображения справедливы не только для электронов, но и для ионов, причем, ввиду большей массы ионов, классические представления для ионов более обоснованы. В соответствии с теоретическими представлениями было найдено, что все осцилляторы отчетливо подразделяются на две группы: у одной удельные заряды по порядку величины близки к удельному заряду электрона, а у другой – к удельному заряду ионов. (Удельный заряд определяется отношением величины заряда к его массе, т.е. ). Первым соответствуют полосы поглощения, лежащие в ультрафиолетовой (реже в видимой), а вторым – в инфракрасной области спектра. Это связано с тем, что массы атомов в десятки тысяч раз больше массы электрона.
Опыт показывает, что интенсивность I плоской световой волны, прошедшей сквозь прозрачный диэлектрик, обнаруживает уменьшение своего значения согласно закону Бугера (установленного экспериментально Бугером и обоснованного теоретически И. Ламбертом):
Рис.6-2. Иллюстрация к закону поглощения Бугера.
I 0 – интенсивность световой волны, вступающей в вещество, d – толщина слоя вещества, пройденного светом, - коэффициент поглощения , зависящий от длины световой волны, химической природы и состояния вещества.
Коэффициент поглощения – физическая величина, обратно пропорциональная слою вещества, при прохождении которого интенсивность падающего света убывает в е (е = 2,72) раз. При измерении коэффициента поглощения необходимо учитывать, что часть света отражается от границы исследуемого вещества. Закон справедлив при не слишком больших интенсивностях света и только для монохроматического излучения, так как для каждого вещества зависит от длины волны.
В тех случаях, когда поглощение осуществляется молекулами вещества, растворенного в практически не поглощающем растворителе, коэффициент поглощенияоказывается пропорциональным числу поглощающих молекул в единице объема, т.е. пропорционален концентрации растворенного вещества С и выражается соотношением: , где – новый коэффициент поглощения, не зависящий от концентрации С и характерный только для молекулы поглощающего вещества. Для растворов закон Бугера принимает вид:
где, d – толщина слоя раствора, через который прошел свет. В таком виде закон поглощения принято называть законом Бугера – Ламберта – Бера.
Оптическая плотность (D ) - мера непрозрачности слоя вещества толщиной d для световых лучей; характеризует ослабление оптического излучения в слоях различных веществ (красителях, светофильтрах, растворах, газах и т.п.).
Для не отражающего слоя оптическая плотность равна:
D
= lg I 0 /I =
,
где I –
интенсивность излучения,
прошедшего поглощающую среду; I
0 – интенсивность падающего излучения. Оптическая плотность может быть определена и как логарифм величины, обратной коэффициенту пропускания
, т.е., D = lg ( 1/).
Коэффициент поглощения и оптическая плотность D связаны соотношением:
Цветные прозрачные тела, красители, растворы обнаруживают селективность (избирательность) поглощения в области видимых лучей, то есть различно поглощают лучи различных длин волн. Например, красными является стекло или раствор, слабо поглощающие красные и оранжевые лучи и сильно поглощающие зеленые и фиолетовые. В общем случае коэффициент зависит от длины волны (или частоты) света. Поглощение велико лишь в области частот, близких к частотам собственных колебаний электронов в атомах. У веществ, атомы (молекулы) которых практически не взаимодействуют (газы и пары металлов при невысоком давлении), коэффициент поглощения для большинства длин волн близок к нулю, и лишь для очень узких областей спектра имеет резкие максимумы (рис.6-3). Эти максимумы соответствуют резонансным частотам колебаний электронов. Газы при высоких давлениях, жидкости и твердые тела дают широкие полосы поглощения (рис.6-4).
Металлы, как известно, практически непрозрачны для света. Это объясняется тем, что под действием электрического поля световой волны, свободные электроны приходят в движение. А движение электрических зарядов под действием электрического поля – это электрический ток (в рассматриваемом случае - быстропеременный), протекание же электрического тока должно непременно сопровождаться выделением джоулева тепла. Таким образом, при освещении светом металлы просто нагреваются, поскольку наблюдаться происходит превращение световой энергии в тепловую
Контрольная работа
Поглощение света
2. Спектры поглощения света
3. Основы спектрофотометрии
4. Спектры поглощения белков
Литература
1. Закон Бугера-Ламберта-Бера
Способность вещества поглощать свет зависит от ряда факторов: электронного строения атомов и молекул, концентрации поглощающих центров, толщины поглощающего слоя и т.д. Впервые этот эффект был изучен Пьером Бугером в 1729 г., который определил количество света, теряющегося при прохождении определенного пути в атмосфере. Как экспериментально установлено Иоганом Ламбертом (1760), интенсивность света, прошедшего через образец, экспоненциально зависит от его толщины:
I (x ) = I o exp (- k 1 x ).
Август Бер (1852) установил аналогичную зависимость от концентрации поглощающих молекул с:
I (с) = I o exp (- k 2 с),
где I 0 интенсивность падающего света, а k 1 и k 2 коэффициенты пропорциональности. Величина T = I / I 0 называется коэффициентом пропускания света, а величина
μ = I погл / I 0 = (I 0 I )/ I 0 = 1- T
коэффициентом поглощения света.
Отсюда можно вывести закон поглощения света в более общем виде. Рассмотрим прохождение монохроматического света через раствор хромофора - окрашенного вещества, т.е. способного поглощать свет, помещенного в прозрачную кювету толщиной l (Рис.1).
Рис.1. Прохождение света через образец толщиной l . I o и I интенсивность падающего и прошедшего света, соответственно.
Пусть в 1 см 3 находится n поглощающих молекул, т.е. их концентрация равна n (см 3 ). Тогда ослабление света при прохождении им тонкого слоя dl равно:
dI / I = - s n dl ,
где коэффициент пропорциональности s называется поперечным сечением поглощения света молекулой хромофора. Размерность s см Смысл этой величины заключается в том, что вероятность поглощения фотона при прохождении света через площадку s равна 1. Величина s определяется видом молекулы, строением ее электронных оболочек, энергетическими уровнями внешних (валентных) электронов и зависит от энергии квантов света, т.е. от его длины волны λ : s = s (λ) .
Интегрируя это выражение:
получим:
I = I 0 e - snl
Это закон Бугера-Ламберта-Бера - важнейший закон фотобиологии.
Вместо числа молекул в 1 см 3 , удобней использовать молярную концентрацию вещества, с [моль/л], и применять десятичные логарифмы. Тогда закон Бугера-Ламберта-Бера будет выражен в более удобном виде:
I = I 0 10 - ε (λ ) cl или I = I 0 10 - D .
Здесь коэффициент пропорциональности ε(λ) называется молярным коэффициентом поглощения или экстинкцией, а величина D (λ) = ε(λ) cl - оптической плотностью (в английской литературе используется обозначение A от английского слова absorbance). Она связана с коэффициентом пропускания света T = I / I 0 соотношением:
D = - lg T .
При малых D < 0.05 коэффициент поглощения пропорционален оптической плотности:
μ = 1- T = 1- 10 ─ D ≈ D ln 10 ≈ 0.434 D
2. Спектры поглощения света
Величины ε(λ) и D (λ), как и s ( ), зависят от набора энергетических уровней электронов в молекуле, т.к. поглощается только свет, способный вызвать соответствующие переходы между ними. Поэтому, изучая зависимости ε(λ) и D (λ), которые называются спектрами поглощения света, можно получить картину энергетических уровней молекулы. Величина ε( ), в отличие от D (λ), зависящей от концентрации вещества и толщины кюветы, зависит только от природы данного вещества, строения его электронных оболочек, и поэтому является его индивидуальной характеристикой. Для хорошо поглощающих свет хромофоров характерны величины порядка 10 3 -10 5 л/моль см.
Рис. 2 Полосы поглощения света растворами хромофоров. Вторая полоса может соответствовать переходу на второй возбужденный уровень или поглощению света другой хромофорной группой (по Владимирову и Потапенко, 2006).
Спектры поглощения атомов в газообразном состоянии, где они практически не взаимодействуют, линейчатые и точно соответствуют дискретным энергетическим уровням атомов. В сложных органических молекулах или в конденсированных средах, например, в растворах, спектры поглощения света ( ) имеют квазинепрерывный вид и представляют собой кривые Гауссового вида (Рис.2) в шкале частот (или энергий фотонов). Уширение спектральных линий происходит вследствие расщепления электронного уровня на множество колебательно-вращательных подуровней. Кроме того, в конденсированных средах, например, в растворах, молекулы хромофора, окружены полярными молекулами растворителя. Их дипольные моменты формируют локальные электрические поля, влияющие на энергии электронных переходов, а следовательно и на положение спектральных линий. Они не квантуются, и это позволяет получить непрерывный набор подсостояний. Суперпозиция большого числа возможных состояний и обусловливает гауссову форму полосы поглощения с центром в точке max , соответствующей частоте наиболее вероятного электронного перехода.
Спектры поглощения света органическими молекулами могут содержать одну или несколько полос, имеющих вид гауссовых кривых в энергетической шкале ε(ν) или (Рис.2). Они характеризуются:
- положением максимумов, т.е. величинами ε max или max , соответствующими энергиями наиболее вероятных электронных переходов;
- числом максимумов, зависящим от числа хромофорных групп в молекуле и взаимодействия их со средой. Например, в спектре поглощения хлорофилла (Рис.3Д) выделяются две полосы в синей и красной области спектра, соответствующие поглощению света порфириновым кольцом и атомом магния, координированным в центре этого кольца. В зависимости от микроокружения магния, красная полоса может существенно смещаться на десятки нанометров. В спектре поглощения хромофора иногда присутствует коротковолновая полоса (Рис.2), соответствующая переходу на второй возбужденный уровень ( S 0 → S 2 ), если энергия такого перехода не слишком велика и соответствует ультрафиолетовой области спектра (>200 нм), которую еще можно изучать с помощью оптических приборов 1 ;
- полушириной
Δε
1/2
, соответствующей ширине полосы на половине ее высоты: 1/2
ε
max
(Рис.2). Она зависит от энергий колебательных и вращательных компонентов, от взаимодействия со средой и обратно пропорциональна времени жизни возбужденного состояния:
Δε
1/2
1/
,
- величиной максимума ε max , примерно пропорциональной площади под спектральной кривой (Рис.2): , которая пропорциональна силе осциллятора f mn , характеризующей вероятность электронного перехода:
Действительно, для кривых нормального распределения (гауссовых кривых) существует приближенное соотношение между величиной максимума, площадью под кривой и полушириной:
Очень важную роль в поглощении света биомолекулами играют углеводородные цепочки с сопряженными связями, в которых чередуются одинарные и двойные связи. В них происходит обобществление π-электронов, которые делокализуются, т.е. распределяются на всю длину цепочки. Это приводит к снижению их общего энергетического уровня до нескольких электрон-вольт - энергии, характерной для ультрафиолетового и видимого диапазонов. Чем длиннее цепочка, т.е. чем выше степень делокализации электронов, тем дальше в красную область спектра смещаются спектры поглощения таких молекул.
Владимиров и Потапенко (2007) приводят простой расчет, качественно доказывающий это утверждение. Если взять цепочку из N звеньев длиной l и общей длиной L = Nl , в которой каждое звено образовано одной одинарной и одной двойной связью, и предположить, что энергия π-электронов в этой цепочке сопряженных связей характеризуется прямоугольной потенциальной ямой, то можно определить распределение этих электронов по энергиям. Действительно, согласно Де Бройлю, движение электрона со скоростью v может быть описано как распространение волны с длиной:
λ = h / m e v ,
где h постоянная Планка. Электрон и характеризующая его волна не должны выходить за пределы цепочки. При этом устойчивое состояние такой системы наблюдается, когда внутри потенциальной ямы возникают стоячие волны с узлами на стенках, т.е. в яме должно помещаться целое число полуволн:
L = nλ /2,
Где n =1,2,3... Следовательно, скорость электрона может принимать дискретные значения:
v = h/m e λ =n h/2m e L,
а его кинетическая энергия также будет квантована:
E n = m e v 2 /2= n 2 h 2 /8 m e L 2
Поскольку на каждом энергетическом уровне могут располагаться только два электрона с противоположными спинами, то в цепи из N звеньев помещаются 2 N электронов на уровнях с энергиями от h 2 /8 m e L 2 до N 2 h 2 /8 m e L
Наиболее длинноволновая полоса поглощения света такой цепочкой соответствует электронному переходу с верхней заполненной молекулярной орбитали на нижнюю свободную орбиталь:
hν = E N +1 - E N .
Следовательно,
Так как L = Nl , то:
При N >2:
То есть длина волны поглощаемого света пропорциональна N . Действительно, цепочки с двумя сопряженными двойными связями имеют максимум поглощения при 233 нм, с тремя при 260-280 нм, а с шестью, как у зрительного пигмента ретиналя, при 360 нм. Это позволяет нам улавливать видимый свет и подвергаться действию ультрафиолета.
На рис.6 приведены спектры поглощения света некоторых важнейших биологических молекул.
3. Основы спектрофотометрии
По спектрам поглощения света можно:
- Идентифицировать вещество по количеству полос, их положению, соотношению максимумов;
- Определить положение возбужденных уровней, т.е. энергии электронных переходов в молекуле хромофора;
- Измерить концентрацию вещества. Поскольку D = ε c l , то для вещества с известным значением молярного коэффициента поглощения ε max измерение оптической плотности D на длине волны max в кювете с заданной толщиной l , позволяет сразу определить концентрацию хромофора c. Если же молярная экстинкция ε max заранее не известна, то сначала строят калибровочный график D (c ) для разных концентраций изучаемого вещества и по нему находят величину c для измеренной величины D .
- Изучить динамику химической реакции, измеряя изменение концентрации какого-то из ее компонентов во времени.
На этом построено огромное множество методов аналитической химии и биохимии. Если в изучаемой реакции образуется или, наоборот, исчезает окрашенный, т.е. поглощающий свет продукт, то с помощью спектрофотометра можно определить его концентрацию и проследить за динамикой реакции. Если исследуемое вещество не окрашено, то применяют специальные красители-индикаторы, меняющие поглощение света при реакции с изучаемым веществом. Если, например, нужно изучить реакцию:
А + В С,
где вещества А, В и С не поглощают видимый свет, но в результате взаимодействия одного из них, например, вещества В с индикатором D образуется вещество S, поглощающее свет:
- В + D S,
то измеряя его оптическую плотность, можно определить концентрации веществ А, В и С, которые линейно связаны с D и S.
В спектрофотометре - приборе для регистрации спектров поглощения вещества - фотоприемником непосредственно измеряется интенсивность света I , прошедшего через образец. Сравнивая ее с интенсивностью света, прошедшего через кювету с растворителем (I 0 ), можно определить коэффициенты пропускания и поглощения света: T = I / I o и μ = 1 T . Однако, удобно измерять не пропускание Т , а оптическую плотность D , которая, в отличие от Т , является аддитивной величиной: оптическая плотность D Σ смеси из нескольких хромофоров , т.е. поглощающих свет веществ, равна сумме оптических плотностей отдельных хромофоров D i :
D Σ = Σ D i
Рис. 3. Спектры поглощения света важнейших биомолекул. А. ДНК (1 двухцепочечная ДНК; 2 ДНК, денатурированная нагреванием; 3 смесь нуклеотидов . Б белок (сывороточный альбумин человека. В зрительный белок родопсин. Г никотинамидадениндинуклеотид, окисленная и восстановленная формы: NAD + и NADH . Д раствор хлорофилла в эфире (1 хлорофилл а ; 2 хлорофилл b . Е флавинадениндинуклеотид (флавинаденинмононуклеотид), окисленная и восстановленная формы: FAD (FMN ) и FADH 2 (FMNH 2 ). Ж гем в составе цитохрома с, окисленная и восстановленная формы; показаны основные полосы: , и .
Поэтому, вычитая оптическую плотность кюветы с растворителем из общей оптической плотности раствора, можно определить оптическую плотность самого хромофора. Для этого в спектрофотометрах имеется логарифмический блок, преобразующий фототок приемника света, пропорциональный I , в сигнал пропорциональный D :
y = k lg I = K D ,
В старых спектрофотометрах эту функцию выполняло специальное электронное устройство, а сейчас ее решают компьютерными средствами.
Приборы для изучения спектров поглощения света называются спектрофотометрами. Они подразделяются на однолучевые и двухлучевые. В однолучевом спектрофотометре (Рис.4А) свет от ксеноновой лампы, излучающей, в отличие от ламп накаливания, не только видимый, но и ультрафиолетовый свет, проходит через монохроматор, который разлагает свет в спектр, из которого с помощью узкой щели выделяет спектральную полосу шириной порядка одного или нескольких нанометров. Для этого используются диспергирующие элементы кварцевые призмы или, в современных приборах, дифракционные решетки, разлагающие белый свет в спектр. Дифракционные решетки отличаются линейной зависимостью угла отклонения луча и независимостью линейной дисперсии от длины волны, большей светосилой и большей обратной линейной дисперсией (0,1-1,0 нм/мм) по сравнению с призмами (1-10 нм/мм), и, наконец, они дешевле. Однако, в ультрафиолетовой области у них более высокий уровень рассеянного света. Поэтому в ультрафиолетовом диапазоне иногда оправдано применение призменных монохроматоров.
Рис. 4. Схема однолучевого (А), двухлучевого (Б) и двухволнового (В) спектрофотометров. Л лампа; М монохроматор; К кюветы; У усилитель; Ком компьютер; П принтер. (По: Владимиров, Потапенко, 2006).
|
|
|
|
|
Рис.5. Устройство спектрофотометра USB4000 фирмы Ocean Optics. А универсальный спектрометр. Б схема измерений. 1 коннектор, для подключения оптического волокна; 2 входная щель шириной от 5 до 200 мкм, регулирующая интенсивность входящего светового потока; 3 длинноволновой светофильтр, отсекающий коротоковолновое излучение, если оно не нужно для измерений (в других случаях он убирается); 4 коллимирующее вогнутое зеркало, формирующее параллельный световой пучок; 5 дифракционная решетка, разлагающая свет в спектр; 6 фокусирующее зеркало; 7 собирающая цилиндрическая линза, фокусирующая свет на линейный детектор; 8 линейка из 3648 CCD элементов, каждый из которых (пиксел) регистрирует свет с определенной длиной волны.
Для более точного выделения монохроматического света с определенной длиной волны применяют двойные монохроматоры, в которых выделенный узкополосный свет дополнительно разлагается второй призмой или решеткой. Если требуется изучить тонкую структуру спектра с максимальным спектральным разрешением, то устанавливается минимальная ширина щели, обычно 0,5-1 нм. Но при этом уменьшается световой поток и требуется максимальная чувствительность фотоприемника. Если не требуется такое высокое спектральное разрешение, то ширину щели увеличивают до 2-5 нм, что существенно снижает требования к чувствительности фотоприемника. Фотоприемник регистрирует свет, прошедший через кювету с образцом. Он, преобразуют световую энергию в электрический ток, пропорциональный интенсивности проходящего света. Далее происходит усиление электрического сигнала, логарифмическое преобразование и регистрация с помощью самописца или компьютера.
Фотоприемником обычно служит фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) или в некоторых современных приборах линейка фотодиодов или CCD элементов 2 (Рис. 5А) ФЭУ - наиболее чувствительный фотоприемник, способный регистрировать даже единичные фотоны, но он значительно дороже и требует высоковольтного питания (700-3000 В), что усложняет и удорожает прибор. Используя линейку CCD элементов, каждый из которых настроен на определенную длину волны, можно сразу зарегистрировать весь спектр и обойтись без дорогостоящей механики, управляющей движением щели, выделяющей монохроматический свет.
При спектрофотометрических измерениях сначала регистрируют фототок, прошедший через контрольную кювету с растворителем. Эти показания преобразуются в величину, пропорциональную оптической плотности D 0 , и запоминаются компьютером. Потом регистрируется фототок, прошедший через ту же кювету, в которую добавлен исследуемый раствор. После логарифмического преобразования сигнала и вычитания D 0 находят чистую оптическую плотность добавленного вещества: D в = D 1 D 0 . Достоинства однолучевого спектрофотометра простота и дешевизна, а недостатки - нестабильность излучения лампы, шумы приемника света, что снижает чувствительность прибора. Обычно чувствительность однолучевых спектрофотометров порядка 10 -3 D .
В качестве примера современного спектрофотометра приведем прибор USB4000 фирмы Ocean Optics (Рис.5). В нем используется многоцелевой волоконно-оптический спектрометр с дифракционной решеткой и линейкой из 3648 CCD элементов. Особенность прибора в том, что свет разлагается в спектр не до, а после прохождения образца. Это позволяет использовать спектрометр как дешевый и миниатюрный (размером всего 15х5 см) универсальный модуль, пригодный как для спектрофотометрических, так и для спектрофлуорометрических измерений. Волоконная оптика позволяет измерять спектры удаленных образцов.
Более чувствительны дифференциальные спектрофотометры, в которых регистрируется не абсолютная величина оптической плотности, а разница в оптической плотности или двух образцов или одного и того же образца при некотором изменении спектра, вызванном химической модификацией, воздействием внешнего фактора или функционированием данной молекулы. В двухлучевом спектрофотометре (Рис.4Б) луч от лампы после монохроматора расщепляется на два с помощью обтюратора - вращающегося зеркала, расположенного под углом 45 о относительно направления луча. Это зеркало имеет такие вырезы, что половину времени монохроматический луч проходит прямо через них на первый образец, а вторую половину отражается зеркалом на другое зеркало и идет через второй образец. Фотоприемник попеременно улавливает свет, прошедший то через одну кювету, то через вторую. Оптические плотности, измеренные в каждом канале, сравниваются, и регистрируется их разница: Δ D = D 1 D Этот метод позволяет измерять малые изменения оптической плотности до 10 -4 D на фоне общего большого поглощения. Его недостаток - сложность и более высокая стоимость прибора.
Рис. 6. Схема измерения молярного коэффициента поглощения света двухволновым методом
Двухволновой спектрофотометр (Рис.4В) используется для изучения образцов, сильно рассеивающих свет, например, клеточных суспензий. Рэлеевское светорассеяние сильно возрастает в ультрафиолетовой области и его вклад в регистрируемый свет (отрезок 2+3 на Рис.6) становится сравнимым с вкладом поглощения света (отрезок 1). Для того, чтобы вычесть эту компоненту, в двухволновом спектрофотометре свет от лампы расщепляется на два луча и проходит через два монохроматора, выделяющих две близкие длины волны λ 1 и λ 2 , одна из которых соответствует изучаемому максимуму, а вторая расположена у его подножия. На волне λ 1 мы регистрируем сумму поглощения света (отрезок 1 на Рис.6) и рассеяния (отрезки 2+3), а на волне λ 2 - только рассеяние (3). Величина светорассеяния в этих близких точках различается на сравнительно небольшую величину (отрезок 2 на рис. 6). Поэтому вычитание интенсивности света, регистрируемого в одном канале, от интенсивности света в другом канале позволяет почти полностью исключить эту компоненту:
I (λ 1 ) I (λ 2 ) = I погл (λ 1 ) + I расс (λ 1 ) - I погл (λ 2 ) - I расс (λ 2 ) ≈ I погл (λ 1 ),
А поскольку при λ 2 интенсивность поглощенного света невелика: I погл (λ 2 ) 0, а рассеяние различается на небольшую величину: I расс (λ 1 ) I расс (λ 2 ) то мы практически измеряем интенсивность света в максимуме поглощения. Относительная ошибка измерений (2)/(1) значительно уменьшилась по сравнению с начальной: (2+3)/(1), где в скобках приведены высоты соответствующих отрезков на Рис.9. Двухволновые спектрофотометры также позволяют снизить помехи, связанные динамическими изменениями светорассеяния вследствие оседания или подвижности биообъектов. Они удобны для кинетических измерений, например, для изучения процессов электронного транспорта в митохондриях или целых клетках. Двухволновой спектрофотометр - очень точный прибор, но сложный и дорогой, так как в нем используются два монохроматора.
Для исследования быстропротекающих фотопроцессов используются методы импульсной спектроскопии. Они были разработаны в 1950-х годах и получили название фдеш-фотолиза. Суть его состоит в исследовании короткоживущих промежуточных фотопродуктов (интермедиатов), образующихся при действии кратковременной мощной вспышки света (flash), с помощью последующего измерения кинетики изменения поглощения света на определенной длине волны, спектров поглощения или флуоресценции этих фотопродуктов через определенный промежуток времени (он может быть очень коротким). Для возбуждения молекул используют импульсные лампы (длительность вспышки порядка микросекунд) или импульсные лазеры, дающие нано-, пико-и даже фемтосекундные (10 -8 ─ 10 -13 с) импульсы. В качестве зондирующего импульса, используемого для регистрации поглощения света, используют более слабую вспышку света или лазерный импульс. Он не должен вызывать фотопревращений биологического объекта, но быть достаточным для надежной регистрации спектральных изменений.
Необходимо помнить, что при D 2 наступает насыщение и прибор не может правильно измерить эту величину. Согласно Владимирову и Потапенко (2006), наименьшая погрешность измерений оптической плотности достигается в интервале 0,2 - 0,8. Поэтому если раствор хромофора чересчур оптически плотен, то его необходимо разбавлять так, чтобы измеряемая величина D попадала в этот интервал. Если величина D недостаточна, то целесообразно или взять кювету с большей толщиной, или увеличить интенсивность падающего света, увеличив ширину щели.
В некоторых случаях закон Бугера-Ламберта-Бера может нарушаться:
- при использовании немонохроматического света зависимость D(с) становится нелинейной;
- при существенном светорассеянии образца, такого как, например, клеточная суспензия, величина оптической плотности D в ультрафиолетовой области будет завышаться, так как измеряемое ослабление света будет состоять не только из поглощения, но и рассеяния;
- при сильной люминесценции образца, испускаемые фотоны могут попадать в фотоприемник, занижая величину D .
- при неравномерном распределении хромофора, например, в виде отдельных гранул, что часто происходит при агрегации молекул, оптическая плотность раствора будет ниже, чем в случае гомогенного распределения (эффект сита).
4. Спектры поглощения белков
Спектры поглощения белков имеют два максимума: при 190 и 280нм (Рис.7). Первый максимум при 190 нм, почти на коротковолновом пределе возможности спектрофотометров, обусловлен поглощением света пептидной группой CO- NH - . В качестве простой модели пептидной группы, на которой были проведены квантово-механические расчеты, служили амиды R 1 - CO - NH - R В пептидной или амидной группе все четыре атома N, C, O и Н лежат в одной плоскости (Рис.8А) и вследствие взаимодействия электронных орбиталей -электроны делокализованы по атомам N, C и O, то есть связь N-C на самом деле не одинарная, а связь С=О - не двойная. Они обе носят частично двойной характер. В этой группе есть три -орбиты, две из которых заняты в основном состоянии. Кроме того, есть пара неподеленных электронов, локализованная на атоме кислорода. Электронные переходы → * поляризованы в плоскости группы. Такие переходы дают наиболее интенсивные полосы поглощения в молекулярных спектрах благодаря высокой степени перекрывания волновых функций основного и возбужденного состояний. Из них переход 1 соответствует полосе поглощения при 190 нм (Рис.7Б). Переход 2 , соответствующий длине волны 165 нм, получен расчетным путем, и зарегистрировать его не удается. Переход n (220 нм) выражен слабо, т.к. электронные облака неподеленной пары n- электронов в атоме кислорода и общих - электронов в возбужденном π состоянии очень слабо перекрываются, потому что их орбитали лежат в почти перпендикулярных плоскостях.
Рис.7. Спектры поглощения спиральной и клубкообразной поли-L-глутаминовой кислоты (По: М. Франк-Каменецкий, 1967).
На поглощение света в области 190 нм влияет спиральность молекулы. У полипептида с α-спиральной структурой молярный коэффициент поглощения ε 190 примерно на 40 % меньше, чем у развернутого полипептида. Этот гипохромный эффект обусловлен почти параллельной ориентацией дипольных моментов электронных переходов в пептидных группах соседних витков, которые в αспиральной структуре располагаются почти параллельно, а в клубке хаотично. При такой пространственной корреляции между ними возникает электростатическое взаимодействие, приводящее к ослаблению поглощения. По гипохромному эффекту можно сравнивать спиральность молекул разных белков. Если принять степень регулярности высокоспирального парамиозина за 100 %, то у миоглобина она будет 83 %, у инсулина - 66 %, у рибонуклеазы - 40 %.
Рис.8. Волновые функции, соответствующие наиболее подвижным электронам в амидной группе (А), и основные электронные переходы (Б) (по: Волькенштейн, 1975).
Максимум при 280 нм обусловлен поглощением -электронной системы ароматических аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина. Наибольшим поглощением на этой длине волны отличается триптофан. Примерно на порядок слабее поглощает тирозин и еще на порядок фенилаланин: три >> тир >> фен . Поэтому если в белке есть хоть один триптофанил, то общее поглощение на длине волны 280 нм будет определяться этим аминокислотным остатком. Этот максимум значительно, на порядок слабее максимума при 190 нм, потому что количество триптофанилов в белке невелико, единицы, а пептидные группы есть в каждом звене. Тем не менее, поглощение УФ света на длине волны 280 нм характерно для всех белков и позволяет идентифицировать их в сложных смесях веществ и в клетках.
5. Спектры поглощения нуклеиновых кислот
Поглощение света нуклеотидами и нуклеиновыми кислотами обусловлено поглощением света пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями. Пиримидины тимин, цитозин и урацил - имеют три нижних орбиты, занятых 6 электронами и три незанятых верхних * орбиты, а также две пары неподеленных электронов у атомов азота ( n орбиты). У пуринов аденина и гуанина есть пять нижних занятых орбит и четыре незанятых верхних * орбит, а также три n орбиты (Рис.9). Поглощение света в обоих случаях практически полностью обусловлено → * переходами, которые, в отличие от n→ * переходов, поляризованы в плоскости оснований.
Рис.9. Схема и n уровней пиримидинов (А) и пуринов (Б). Стрелками показаны длинноволновые → * и n→ * переходы. Точки изображают неподеленные пары электронов.
Максимум спектра поглощения всех нуклеотидов лежит в области 260 нм и только у цитидина он несколько смещен к 270 нм. Полоса поглощения света высокомолекулярными ДНК и РНК с максимумом около 260 нм (Рис.3А) представляет собой сумму полос поглощения отдельных нуклеотидов. Эта полоса визитная карточка нуклеиновых кислот, которые поглощению на длине волны 260 нм можно идентифицировать и измерять их количество.
Оптическая плотность полимерной ДНК примерно на 40 % меньше, чем суммарная оптическая плотности смеси соответствующих нуклеотидов. Этот гипохромный эффект обусловлен пространственной корреляцией отдельных нуклеотидов. Поскольку основной вклад в поглощение на длине волны 260 нм дают переходы, дипольные моменты которых лежат в плоскости молекулы гетероциклов азотистых оснований, то при расположении оснований в параллельных плоскостях они взаимодействует, что снижает вероятности переходов. По гипохромному эффекту нуклеиновых кислот при 260 нм можно оценивать степень их спиральности и ее изменения при действии разных факторов, например, при денатурации. Соответственно, изучая поглощение света при 260 нм, можно следить за ходом денатурации ДНК. Температура денатурации ДНК зависит от средней энергии связей, приходящейся на пару оснований. Так как пары А-Т имеют две, а пары Г-Ц - три водородные связи, то температура денатурации ДНК линейно зависит от процента Г-Ц пар. Поэтому, измеряя спектры поглощения нативной и денатурированной ДНК, можно определить процент Г-Ц пар в ней.
6. Некоторые факторы, влияющие на адсорбционные свойства хромофоров
Хотя основным фактором, определяющим спектральные свойства хромофоров, является его молекулярная структура, окружающая среда: как растворитель, так и микроокружение хромофорной группы в составе биополимера, влияют на спектры поглощения хромофоров. Среди этих факторов важны полярность растворителя, соседних молекул и/или молекулярных группировок в составе белков или мембран, в которые может быть встроен хромофор, их ориентация, рН среды и т.д.
При изменении рН раствора ионное состояние хромофора может изменяться. Например, молекулы, содержащие такие группы как -СООН или -ОН могут диссоциировать. При этом обычно молярный коэффициент поглощения увеличивается и смещается максимум поглощения света. Например, при изменении рН от 6 до 13 у тирозина происходит диссоциация группы ОН. При этом max увеличивается вдвое, а max смещается от 274 до 295 нм.
Полярность растворителя влияет на полярные группы хромофора, особенно, если в нем есть гетероатомы O, N или S. Обычно при замене полярного растворителя на неполярный max сдвигается вправо, в красную область спектра (батохромный сдвиг).
Параллельное расположение хромофорных групп приводит к гипохромии, как в случае пептидных групп в белках (при 190 нм) или нуклеотидов в двуспиральной ДНК (при 260 нм). Так же возможен спектральный сдвиг. Например, при агрегации молекул хлорофилла появляются, так называемые “нативные формы хлорофилла” со сдвигом max .
Фрайфельдер (1980) сформулировал ряд эмпирических правил, полезных при интерпретации спектров поглощения биологических макромолекул:
1. В неполярном макроокружении молярный коэффициент поглощения аминокислот триптофана, тирозина, фенилаланина или гистидина увеличивается, а max смещается вправо. Поэтому если в водном растворе белка величины и max триптофана или тирозина больше, чем у свободных аминокислот, то эти аминокислоты находятся в неполярном микроокружении внутри белковой глобулы, где они недоступны для воды. Если и max триптофана или тирозина, входящих в состав белка, чувствительны к изменению полярности растворителя, то можно заключить, что аминокислота, для которой наблюдаются изменения этих параметров, располагается на поверхности белка.
У аминокислот, содержащих группы, зарядовое состояние которых может изменяться, таких как OH группа тирозина или группа SH цистеина, и max всегда увеличиваются, когда эти группы заряжены. Поэтому если спектр такой аминокислоты не изменяется в условиях, когда, она должна ионизироваться, например, при изменении рН среды, то значит, эта аминокислота спрятана в неполярной области белка. Если же значение рК ионизируемой аминокислоты, определенное по изменению спектра при изменении рН, такое же, как и для свободной аминокислоты в растворе, то она находится на поверхности белка. Но если рК сильно отличается, то эта аминокислота находится в еще более полярном окружении, например, тирозин среди групп -СОО ─ .
3. У пуринов и пиримидинов уменьшается по мере того, как плоскости их молекул становятся параллельными и сближаются друг с другом, т.е. когда возрастает стэкинг-взаимодействие. Поэтому уменьшается в ряду: свободное основание > основание в составе одноцепочечного полинуклеотида без стекинга > основание в составе одноцепочечного полинуклеотида со стекингом > основания в составе двухцепочечного полинуклеотида.
7. Несколько примеров применения абсорбционной спектроскопии
Так как в белках свет поглощают в основном триптофан и тирозин, а содержание их в белках невелико, то изменение спектров поглощения (пертурбация) под влиянием разных факторов (температура, рН, растворитель, химические агенты) может дать ценные сведения о структуре белка, характере связывания коферментов, красителей и других групп, образовании фермент-субстратных и фермент-ингибиторных комплексов. Суть метода состоит в том, что некоторые остатки триптофана и тирозина могут находиться на поверхности белковой глобулы. Их называют доступными, и они обычно подвергаются действию разных внешних факторов. Другие ароматические остатки спрятаны внутри глобулы и не подвергаются влиянию растворителя. Полная их доступность достигается при разрушении конформации белка, например, при денатурации. Отношение числа доступных остатков к общему числу может служить характеристикой конформации белка в данном растворителе. Для оценки числа доступных аминокислотных остатков в раствор белка добавляют “пертурбант” органическое вещество, с меньшей полярностью, чем вода, например, глюкозу, сахарозу, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид, этанол или глицерин в концентрации около 20 %, которое не слишком изменяет конформацию макромолекулы, но дает реально измеряемый сдвиг полосы поглощения за счет изменения полярности среды. Прецезионные дифференциальные спектрофотометры позволяют зарегистрировать спектральный сдвиг на 0,1-1 нм. В них в один канал помещают кювету с раствором белка без пертурбанта, а в другой такую же кювету, но с пертурбантом, и регистрируют разностный спектр. Этот метод очень чувствителен, он позволяет зарегистрировать спектральные сдвиги до 10 -5 D . Например, для -химотрипсиногена показано наличие 3 доступных и 4-х спрятанных триптофанилов.
Дифференциальная спектрофотометрия также может использоваться для исследования активных центров ферментов. Например, при добавлении различных субстратов к лизоциму наблюдается красный сдвиг полосы поглощения триптофана. Его величина соответствует сдвигу при перемещении одного триптофанового остатка из водной среды в неполярную. Это позволяет предположить присутствие триптофана в центре связывания субстрата. Данные такого несложного спектрофотометрического анализа были подтверждены результатами рентгеноструктурного исследования.
В молекулу белка можно ввести дополнительную хромофорную группу, имеющую спектр, отличный от спектра собственных белковых хромофоров. Изучая изменение ее спектральных свойств, можно судить об изменениях структуры белка. Такие группы называются репортерными. Например, к тирозину в активном центре карбоксипептидазы можно химически присоединить арсаниловую кислоту, спектр поглощения которой очень чувствителен к ионам цинка. По этим данным определили, что центр связывания цинка находится вблизи от активного центра фермента. Интересно, что по данным рентгеноструктурного анализа эти центры находятся на значительном расстоянии. Следовательно, структура этого белка в кристаллах, используемых для рентгеноструктурного анализа, существенно отличается от его структуры в растворе.
ЛИТЕРАТУРА
Миронов А.В.: Основы астрофотометрии. - М.: Физматлит, 2008
Селеменев В.Ф.: Меланоидины. - Воронеж: Воронежский государственный университет, 2004
Э.Н. Аксенова, О.П. Андрианова, А.П. Арзамасцева и др.; Под ред. А.П. Арзамасцева: Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии. - М.: Медицина, 2011
И.Я. Гурецкий, В.В. Кузнецов, Л.Б. Кузнецова и др.; Под ред. О.М. Петрухина: Практикум по физико-химическим методам анализа. - М.: Химия, 2007
Кондратьев К.Я.: Аэрокосмические исследования почв и растительности. - Л.: Гидрометеоиздат, 2006
Под ред. И.Н. Глушневой; И.Б. Волошина, И.Н. Глушнева и др. : Спектрофотометрия ярких звезд. - М.: Наука, 2002
Джадд Д.: Цвет в науке и технике. - М.: МИР, 2008
Берштейн И.Я.: Спектрофотометрический анализ в органической химии. - Л.: Химия, 1975
Раков А.В.: Спектрофотометрия тонкоплёночных полупроводниковых структур. - М.: Советское радио, 1975
Булатов М.И.: Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа. - Л.: Химия, 1968
I
1 2 , нм
1 Существующие приборы с кварцевой оптикой не позволяют регистрировать излучение с длиной волны менее 185-190 нм. В этой области также сильно возрастает поглощение света воздухом и водой.
2 CCD (Charge-Coupled Device), по русски прибор с зарядовой связью (ПЗС).
